Ферментативные реакции и действие некоторых эффекторов

§ 12. Кинетика ферментативных реакций

Ферментативные реакции и действие некоторых эффекторов

§ 12. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Кинетика ферментативных реакций – наука о скоростях ферментативных реакций, их зависимости от различных факторов. Скорость ферментативной реакции определяется химическим количеством прореагировавшего субстрата или образовавшегося  продукта реакции в единицу времени в единице объема при определенных условиях:

,

где v – скорость ферментативной реакции,  – изменение концентрации субстрата или продукта реакции, t – время. 

Скорость ферментативной реакции зависит от природы фермента, которая определяет его активность. Чем выше активность фермента, тем выше скорость реакции.

Активность фермента определяют по скорости реакции, катализируемой ферментом. Мерой активности фермента является одна стандартная единица активности фермента.

Одна стандартная единица активности фермента – это такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту.

В процессе ферментативной реакции фермент (Е) взаимодействует с субстратом (S), в результате образуется фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с высвобождением фермента и продукта (Р) реакции:

Скорость ферментативной реакции зависит от многих факторов: от концентрации субстрата и фермента, температуры, рН среды, наличия различных регуляторных веществ, способных увеличивать или снижать активность ферментов.

Интересно знать! Ферменты используются в медицине для диагностики различных заболеваний. При инфаркте миокарда вследствие повреждения и распада сердечной мышцы в крови резко возрастает содержание ферментов аспартаттрансаминазы и аланинаминотрансферазы. Выявление их активности позволяет диагностировать данное заболевание.

Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Рассмотрим влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции (рис. 30.).

При низких концентрациях субстрата скорость прямо пропорциональна его концентрации, далее с ростом концентрации скорость реакции увеличивается медленнее, а при очень высоких концентрациях субстрата скорость практически не зависит от его концентрации и достигает своего максимального значения (Vmax).

При таких концентрациях субстрата все молекулы фермента находятся в составе фермент-субстратного комплекса, и достигается полное насыщение активных центров фермента, именно поэтому скорость реакции в этом случае практически не зависит от концентрации субстрата.

Рис. 30. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

График зависимости активности фермента от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса – Ментен, которое получило свое название в честь выдающихся ученых Л.Михаэлиса и М.Ментен, внесших большой вклад в исследование кинетики ферментативных реакций,

где v – скорость ферментативной реакции; [S] – концентрация субстрата; KM – константа Михаэлиса.

Рассмотрим физический смысл константы Михаэлиса. При условии, что v = ½ Vmax, получаем KM = [S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.

Скорость ферментативной реакции зависит и от концентрации фермента (рис. 31). Эта зависимость носит прямолинейный характер.

Рис. 31. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на рис. 32.

Рис. 32. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.

При низких температурах (приблизительно до 40 – 50 оС) повышение температуры на каждые 10 оС в соответствии с правилом Вант-Гоффа сопровождается увеличением скорости химической реакции  в  2 – 4  раза.

При  высоких  температурах   более 55 – 60  оС активность фермента резко снижается из-за его тепловой денатурации, и, как следствие этого, наблюдается резкое снижение скорости ферментативной реакции. Максимальная активность ферментов наблюдается обычно в пределах 40 – 60 оС.

Температура, при которой активность фермента максимальна, называется температурным оптимумом. Температурный оптимум ферментов термофильных микроорганизмов находится в области более высоких температур.

Влияние рН на скорость ферментативной реакции

График зависимости ферментативной активности от рН представлен на рис. 33.

Рис. 33. Влияние рН на скорость ферментативной реакции

График зависимости от рН имеет колоколообразную форму. Значение рН, при котором активность фермента  максимальна, называется рН-оптимумом фермента. Значения рН-оптимума для различных ферментов колеблются в широких пределах.

ФерментрН-оптимум
Пепсин1,5
Фосфатаза5,8
Уреаза6,7
Трипсин7,7
Каталаза7,6
Аргиназа9,7

Характер зависимости ферментативной реакции от рН определяется тем, что этот показатель оказывает влияние на:

a) ионизацию аминокислотных остатков, участвующих в катализе,

b) ионизацию субстрата,

c) конформацию фермента и его активного центра.

 

Ингибирование ферментов

Скорость ферментативной реакции может быть снижена действием ряда химических веществ, называемых ингибиторами. Некоторые ингибиторы являются для человека ядами, например, цианиды, другие – используются в качестве лекарственных препаратов.

Ингибиторы можно разделить на два основных типа: необратимые и обратимые. Необратимые ингибиторы (I) связываются с ферментом с образованием комплекса, диссоциация которого с восстановлением  активности фермента невозможна:

E + I  EI.

Примером необратимого ингибитора является диизопропилфторфосфат (ДФФ). ДФФ ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющего важную роль в передаче нервного импульса. Этот ингибитор взаимодействует с серином активного центра фермента, блокируя тем самым активность последнего.

Вследствие этого нарушается способность отростков нервных клеток нейронов проводить нервный импульс. ДФФ является одним из первых веществ нервно-паралитического действия.

На его основе создан ряд относительно нетоксичных для человека и животных инсектицидов – веществ, ядовитых для насекомых.

Обратимые ингибиторы, в отличие от необратимых, при определенных условиях могут быть легко отделены от фермента. Активность последнего при этом восстанавливается:

.

Среди обратимых ингибиторов выделяют конкурентные и неконкурентные ингибиторы.

Конкурентный ингибитор, являясь структурным аналогом субстрата, взаимодействует с активным центром фермента и таким образом перекрывает доступ субстрата к ферменту.

При этом ингибитор не подвергается химическим превращениям и связывается с ферментом обратимо.  После диссоциации комплекса EI фермент может связаться либо с субстратом и преобразовать его, либо с ингибитором (рис. 34.).

Поскольку и субстрат и ингибитор конкурируют за место в активном центре,  такое ингибирование называется конкурентным.

Рис. 34. Механизм действия конкурентного ингибитора.

Конкурентные ингибиторы используются в медицине. Для борьбы с инфекционными болезнями ранее широко применялись сульфаниламидные препараты. Они близки по своей структуре к пара-аминобензойной кислоте (ПАБК), необходимому фактору роста многих патогенных бактерий.

ПАБК является предшественником фолиевой кислоты, которая служит кофактором ряда ферментов.

  Сульфаниламидные препараты выступают в качестве конкурентного ингибитора ферментов синтеза фолиевой кислоты из ПАБК и тем самым подавляют рост и размножение патогенных бактерий.

Неконкурентные ингибиторы по структуре не сходны с субстратом и при образовании EI взаимодействуют не с активным центром, а с другим участком фермента. Взаимодействие ингибитора с ферментом приводит к изменению структуры последнего. Образование EI-комплекса является обратимым, поэтому после его распада фермент вновь способен атаковать субстрат (рис. 35).

Рис. 35.  Механизм действия неконкурентного ингибитора 

В качестве неконкурентного ингибитора может выступать цианид CN-. Он связывается с ионами металлов, входящими в состав простетических групп и подавляет активность этих ферментов. Отравления цианидами крайне опасны. Они могут привести к летальному исходу.

Аллостерические ферменты

Термин «аллостерический» происходит от греческих слов allo – другой, stereo – участок. Таким образом, аллостерические ферменты наряду с активным центром имеют другой центр, называемый аллостерический центр (рис. 36).

С аллостерическим центром связываются вещества, способные изменять активность ферментов, эти вещества называют аллостерическими эффекторами. Эффекторы бывают положительными – активирующими фермент, и отрицательными – ингибирующими, т.е. снижающими активность фермента.

Некоторые аллостерические ферменты могут подвергаться действию двух и более эффекторов.

Рис. 36. Структура аллостерического фермента.

Регуляция мультиферментных систем

Некоторые ферменты действуют согласованно, объединяясь в мультиферментные системы, в которых каждый фермент катализирует определенную стадию метаболитического пути:

В мультиферментной системе есть фермент, который определяет скорость всей последовательности реакций. Этот фермент, как правило, бывает аллостерическим и находится в начале матаболитического пути. Он способен, получая различные сигналы, как повышать, так и понижать скорость катализируемой реакции, тем самым регулируя скорость всего процесса.

Источник: https://ebooks.grsu.by/osnovi_biohimii/12-kinetika-fermentativnykh-reaktsij.htm

Активирование и ингибирование ферментов

Ферментативные реакции и действие некоторых эффекторов

Скорость ферментативной реакции, как и активность фермента, в значительной степени определяется также присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции, а вторые тормозят эту реакцию. Активирующее влияние на скорость ферментативной реакции оказывают разнообразные вещества органической и неорганической природы. Так, соляная кислота активирует действие пепсина желудочного сока;

желчные кислоты повышают активность панкреатической липазы; некоторые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), растительная протеиназа и др. в значительной степени активируются соединениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а ряд ферментов – также витамином С.

Особенно часто активаторами выступают ионы двухвалентных и, реже, одновалентных металлов. Получены доказательства, что около четверти всех известных ферментов для проявления полной каталитической активности нуждаются в присутствии металлов. Многие ферменты вообще не активны в отсутствие металлов.

Так, при удалении цинка угольная ангидраза (карбоангидраза), катализирующая биосинтез и распад Н2СО3, практически теряет свою ферментативную активность; более того, цинк при этом не может быть заменен никаким другим металлом.

Известны ферменты , действие которых активируется ионами нескольких металлов; в частности, енолаза активируется Mg2+, Mn2+, К+ (табл. 4.4).

Молекулярный механизм действия металлов в энзиматическом катализе, или роль металлов в активировании ферментами.

В ряде случаев ионы металлов (Со2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+) выполняют функции простетических групп ферментов, или служат акцепторами и донаторами электронов, или выступают в качестве электрофилов либо нуклеофилов, сохраняя реактивные группы в необходимой ориентации.

В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-субстратного комплекса. Например, ионы Mg2+через отрицательно заряженную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфатных эфиров органических веществ к активному центру фосфатаз, катализирующих гидролиз этих соединений.

Иногда металл соединяется с субстратом, образуя истинный субстрат, на который действует фермент. В частности, ионы Mg2+активируют креатинфосфокиназу благодаря образованию истинного субстрата – магниевой соли АТФ.

Наконец, имеются экспериментальные доказательства прямого участия металлов (например, ионов Са2+ в молекуле амилазы слюны) в формировании и стабилизации активного центра и всей трехмерной структуры молекулы фермента. Следует отметить также, что металлы нередко выступают в роли аллостерических модуляторов (эффекторов; см. рис. 4.22). Взаимодействуя с аллостеричес-ким центром, подобный металл (эффектор) способствует образованию наиболее выгодной пространственной конфигурации фермента и активного фермент-субстратного комплекса.

Анионы в физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказывают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение составляют пепсин, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами, а также амилаза слюны, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается при действии ионов хлора, и аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов.

Ингибиторы ферментов обычно принято делить на два больших класса: обратимые и необратимые. Это вещества, вызывающие частичное (обратимое) или полное торможение реакций, катализируемых ферментами.

Недавно открыты антиферменты (антиэнзимы, или антизимы), представляющие собой белки (или полипептиды), действующие как ингибиторы ферментов. К подобным веществам относятся, например, ингибитор трипсина, обнаруженный в соевых бобах, и сывороточный антитрипсин.

Недавно открыт в печени животных антифермент орнитинде-карбоксилазы (см. главу 12). Антизимы, вероятнее всего, образуют трудно-диссоциируемые комплексы с соответствующими ферментами, выключая их из химических реакций.

Иногда ингибитор является составным компонентом предшественника фермента, например пепсина (см. главу 12), или входит в состав сложных комплексов ферментов, например в состав протеинкиназы и протеинфосфатазы, катализирующих процессы фосфо-рилирования-дефосфорилирования в живых организмах.

Однако до сих пор не выяснено, являются ли подобные антиферменты истинными ингибиторами или регуляторными субъединицами, в частности, какова разница в назначении регуляторной (R) субъединицы в составе протеинкиназы и ингибиторной (I) субъединицы в составе протеинфосфатазы.

Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка (кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов, нагревание), приводят к необратимой инактивации фермента. Однако подобное инак-тивирование относительно неспецифично, оно не связано с механизмом действия ферментов.

Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на какой-либо один фермент или группу родственных ферментов, вызывая обратимое или необратимое ингибирование. Исследование этих ингибиторов имеет важное значение.

Во-первых, ингибиторы могут дать ценную информацию о химической природе активного центра фермента, а также о составе его функциональных групп и природе химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса.

Известны вещества, включая лекарственные препараты, специфически связывающие ту или иную функциональную группу в молекуле фермента, выключая ее из химической реакции.

Так, йодацетат IСН2—СООН, его амид и этиловый эфир, пара-хлормеркурибензоат ClHg—С6Н4—СООН и другие реагенты сравнительно легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами ферментов. Если такие группы имеют существенное значение для акта катализа, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента:

R-SH + IСН2—СООН —> НI + R—S—CH2—COOH

Действие ряда других ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрип-син) сильно тормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями, например ДФФ, вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы серина в активном центре (см. ранее).

Во-вторых, ингибиторы нашли широкое применение в энзимологии при исследовании природы множественных форм ферментов и изоферментов, различающихся не столько электрофоретической подвижностью, сколько различной чувствительностью к одному и тому же ингибитору.

При помощи ингибиторов, выключающих отдельные стадии многоступенчатого метаболического процесса, могут быть точно установлены не только последовательность химических реакций, но и природа участвующих в этих превращениях ферментов.

Этим путем, применяя йодацетат, фториды и другие специфические ингибиторы, был расшифрован глико-литический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы до стадии образования молочной кислоты в мышечной ткани, насчитывающий 11 стадий с участием 11 ферментов и 10 промежуточных метаболитов.

С ингибированием ферментов связан механизм действия многих токсинов и ядов на организм.

Известно, что при отравлениях солями сенильной кислоты смерть наступает вследствие полного торможения и выключения дыхательных ферментов (цитохромная система) тканей, особенно клеток мозга.

Токсическое влияние на организм человека и животных некоторых инсектицидов обусловлено торможением активности холинэстеразы – фермента, играющего ключевую роль в деятельности нервной системы.

Современная, так называемая рациональная, химиотерапия (направленное применение лекарственных препаратов в медицине) должна основываться на точном знании механизма действия лекарственных средств на биосинтез ферментов, на активность уже синтезированных ферментов или на регуляцию их активности в организме.

Иногда для лечения некоторых болезней используют избирательно действующие ингибиторы. Так, ингибитор ряда протеиназ (трипсина, химотрипсина и калликреина) трасилол широко применяется для лечения острого панкреатита – болезни, при которой уровень трипсина и химотрипсина в крови резко возрастает.

Знание избирательного ингибиторного действия некоторых природных и синтетических соединений (так называемых антиметаболитов) на ферменты может служить методологической основой для разработки эффективных методов синтеза химиотерапевтических препаратов.

Этот путь открывает широкие возможности для направленного воздействия на синтез ферментов в организме и регуляции интенсивности метаболизма при патологии.

Типы ингибирования. Различают обратимое и необратимое ингибиро-вание. Если ингибитор вызывает стойкие изменения пространственной третичной структуры молекулы фермента или модификацию функциональных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым.

Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-Ментен.

Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата.

Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с субстратсвязывающим (активным) центром. Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой.

Этот фермент катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фумаровую:

Если в среду добавить малонат (ингибитор), то в результате структурного сходства его с истинным субстратом сукцинатом (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) он будет взаимодействовать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом полностью исключается перенос атома водорода от малоната. Структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат) все же несколько различаются. Поэтому они конкурируют за связывание с активным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Таким образом, ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя фермент-ингибиторный комплекс. Этот тип ингиби-рования иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (рис. 4.20).

В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом ЕI, в отличие от фермент-субстратного комплекса ES не распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциации комплекса EI, или ингибиторную константу Кi, можно, следуя теории Михаэлиса–Мен-тен, определить как отношение констант обратной и прямой реакций:

т.е. ингибиторная константа прямо пропорциональна произведению концентрации фермента и ингибитора и обратно пропорциональна концентрации комплекса EI.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике.

Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты.

Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью

Рис. 4.20. Действие конкурентного ингибитора (схема по В.Л. Кретовичу). Е – фермент; S – субстрат; Р1 и Р2 – продукты реакции; I – ингибитор.

ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензой-ной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.

Некоторые аналоги витамина В6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин и аминоптерин (см.

главу 7), действуют как конкурентные, так называемые коферментные, ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие интенсивно протекающие при патологии биологические процессы в организме.

Применение подобных аналогов в медицинской практике (в частности, в дерматологии и онкологии) основано на конкурентном вытеснении коферментов из субстратсвязывающих центров ключевых ферментов обмена.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент.

При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты.

Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов и молекуле фермента.

Следует указать, что неконкурентное ингибирование также может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр. Примеры необратимого ингибирования приведены ранее.

При обратимом неконкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I связываются с разными центрами, поэтому появляется возможность образования как комплекса EI, так и тройного комплекса EIS; последний может распадаться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комплекс ES.

Этот тип неконкурентного ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов, катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата с активным центром. Ингибитор при этом соединяется как со свободным ферментом, так и с ES-комплексом.

Известно, кроме того, так называемое бесконкурентное ингиби-рование, когда ингибитор связывается с ферментом также в некаталитическом центре, однако не со свободным ферментом, а только с ES-комплексом в виде тройного комплекса.

Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнениями Михаэлиса-Ментен, Лайнуивера-Бэрка или другими, например уравнением Эди-Хофсти:

ν = -Km(y/[S]) + Vmax

и соответствующими графиками в прямолинейных координатах.

Рнс. 4.21. Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии конкурентного ингибитора.

а – в координатах v от [ S ] ; б – в координатах 1/v от 1 / [ S ] ; Vmaxи Vi – максимальные скорости реакции; Кm и Kmi – константа Михаэлиса соответственно в отсутствие (1) и в присутствии (2) ингибитора.

Рис. 4.22. Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии неконкурентного ингибитора. Обозначения те же, что на рис. 4.21.

При конкурентном типе ингибирования ингибитор увеличивает значение Кm, не оказывая влияния на максимальную скорость Vmax(рис. 4.21). Это означает, что при достаточно высокой концентрации субстрата [ S ] ингибитор вытесняется молекулами субстрата из комплекса EI. При неконкурентном ингибировании (рис. 4.

22) ингибитор снижает величину максимальной скорости. Если при этом величина Кm не уменьшается, то говорят о полностью неконкурентном ингибировании. Подобный тип ингибиро-вания имеет место при образовании неактивных, труднодиссоциирующих комплексов EI и(или) EIS.

Часто, однако, наблюдается смешанный тип ингибирования, иногда называемый частично неконкурентным, или обратимым неконкурентным ингибированием (см. ранее), при котором снижение Vmaxсочетается с одновременным увеличением значений Кm. Это означает, что комплекс EI сохраняет частичную активность, т.е.

способность к образованию промежуточного тройного комплекса EIS, в котором субстрат подвергается замедленному каталитическому превращению. В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата.

Для этого типа торможения был предложен, как отмечено ранее, довольно неточный термин «бесконкурентное ингибирование». Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соединения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса EIS.

Таким образом, при графическом анализе скоростей ферментативных реакций как функции концентраций субстрата может быть получена ценная информация не только о кинетике ферментативных реакций, но и о молекулярных механизмах ферментативного катализа.

Предыдущая страница | Следующая страница

СОДЕРЖАНИЕ

Источник: http://www.xumuk.ru/biologhim/053.html

Ферменты

Ферментативные реакции и действие некоторых эффекторов

Глава IV.3.

Обмен  веществ в организме можно определить как совокупность всех химических превращений, которым подвергаются соединения, поступающие извне.

Эти превращения включают все известные виды химических реакций: межмолекулярный перенос функциональных групп, гидролитическое и негидролитическое расщепления химических связей, внутримолекулярная перестройка, новообразование химических связей и окислительно – восстановительные реакции.

Такие реакции протекают в организме с чрезвычайно большой скоростью только в присутствии катализаторов. Все биологические катализаторы представляют собой вещества белковой природы и носят названия ферменты (далее Ф) или энзимы (Е).

Ферменты не являются компонентами реакций, а лишь ускоряют достижение равновесия увеличивая скорость как прямого, так и обратного превращения. Ускорение реакции происходит за счет снижении энергии активации – того энергетического барьера, который отделяет одно состояние системы (исходное химическое соединение) от другого (продукт реакции).

Ферменты ускоряют самые различные реакции в организме. Так достаточно простая с точки зрения традиционной химии реакция отщепления воды от угольной кислоты с образованием СО2 требует участия фермента, т.к.

без него она протекает слишком медленно для регулирования рН крови.

Благодаря каталитическому действию ферментов в организме становится возможным протекание таких реакций, которые без катализатора шли бы в сотни и тысячи раз медленнее.

Свойства ферментов

1. Влияние на скорость химической реакции: ферменты увеличивают скорость химической реакции, но сами при этом не расходуются.

Скорость реакции – это изменение концентрации компонентов реакции в единицу времени.

Если она идет в прямом направлении, то пропорциональна концентрации реагирующих веществ, если в обратном – то пропорциональна концентрации продуктов реакции.

Отношение скоростей прямой и обратной реакций называется константой равновесия. Ферменты не могут изменять величины константы равновесия, но состояние равновесия в присутствии ферментов наступает быстрее.

2. Специфичность действия ферментов. В клетках организма протекает 2-3 тыс. реакций, каждая из которые катализирутся определенным ферментом. Специфичность действия фермента – это способность ускорять протекание одной определенной реакции, не влияя на скорость остальных, даже очень похожих.

Различают:

Абсолютную – когда Ф катализирует только одну определенную реакцию (аргиназа – расщепление аргинина)

Относительную (групповую спец) – Ф катализирует определенный класс реакций (напр. гидролитическое расщепление) или реакции при участии определенного класса веществ.

Специфичность ферментов обусловлена их уникальной аминокислотной последовательностью, от которой  зависит конформация активного центра, взаимодействующего с компонентами реакции.

Вещество, химическое превращение которого катализируется ферментом носит название субстрат (S).

3. Активность ферментов – способность в разной степени ускорять скорость реакции. Активность выражают в:

1) Международных единицах активности – (МЕ) количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ субстрата за 1 мин.

2)  Каталах (кат) – количество катализатора (фермента), способное превращать 1 моль субстрата за 1 с.

3) Удельной активности – число единиц активности (любых из вышеперечисленных) в исследуемом образце к общей массе белка в этом образце.

4) Реже используют молярную активность – количество молекул субстрата превращенных одной молекулой фермента за минуту.

Активность зависит в первую очередь от температуры. Наибольшую активность тот или иной фермент проявляет при оптимальной температуре. Для Ф живого организма это значение находится в пределах +37,0 – +39,0 °С, в зависимости от вида животного.

При понижении температуры, замедляется броуновское движение, уменьшается скорость диффузии и, следовательно, замедляется процесс образования комплекса между ферментом и компонентами реакции (субстратами).

В случае повышения температуры выше +40 – +50 °С молекула фермента, которая является белком, подвергается процессу денатурации. При этом скорость химической реакции заметно падает (рис. 4.3.1.).

Активность ферментов  зависит также от рН среды. Для большинства из них существует определенное оптимальное значение рН, при котором их активность максимальна.

Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов и для каждого из них существуют свои пределы опт рН, то изменение рН это один из важных факторов регуляции ферментативной активности.

Так, в результате одной химреакции при участии определенного фермента рН опт которого лежит в перделах 7.0 – 7.2 образуется продукт, который является кислотой. При этом значение рН смещается в область 5,5 – 6.0.

Активность фермента резко снижается, скорость образования продукта  замедляется, но при этом активизируется другой фермент, для которого эти значения рН оптимальны и продукт первой реакции подвергается дальнейшему химическому превращению. (Еще пример про пепсин и трипсин).

Химическая природа ферментов. Строение фермента. Активный и аллостерический центры

Все ферменты это белки с молекулярной массой от 15 000 до нескольких млн Да. По химическому строению различают простые ферменты (состоят только из АК) и сложные ферменты (имеют небелковую часть или простетическую группу).

Белковая часть носит название – апофермент, а небелковая, если она связана ковалентно с апоферментом, то называется кофермент, а если связь нековалентная (ионная, водородная) – кофактор.

Функции простетической группы следующие: участие в акте катализа, осуществление контакта между ферментом и субстратом, стабилизация молекулы фермента в пространстве.

В роли кофактора обычно выступают неорганические вещества  – ионы цинка, меди, калия, магния, кальция, железа, молибдена.

Коферменты можно рассматривать как составную часть молекулы фермента. Это органические вещества, среди которых различают: нуклеотиды (АТФ, УМФ, и пр), витамины или их производные (ТДФ – из тиамина (В1), ФМН – из рибофлавина (В2), коэнзим А – из пантотеновой кислоты (В3), НАД и пр) и тетрапиррольные коферменты – гемы.

В процессе катализа реакции в контакт с субстратом вступает не вся молекула фермента, а определенный ее участок, который называется активным центром. Эта зона молекулы не состоит из последовательности аминокислот, а формируется при скручивании белковой молекулы в третичную структуру.

Отдельные участки аминокислот сближаются между собой, образуя определенную конфигурацию активного центра. Важная особенность строения активного центра – его поверхность комплементарна поверхности субстрата, т.е. остатки АК этой зоны фермента способны вступать в химическое взаимодействие с определенными группами субстрата.

Можно представить, что активный центр фермента совпадает со структурой субстрата как ключ и замок.

В активном центре различают две зоны: центр связывания, ответственный за присоединение субстрата, и каталитический центр, отвечающий за химическое превращение субстрата. В состав каталитического центра большинства ферментов входят такие АК, как Сер, Цис, Гис, Тир, Лиз. Сложные ферменты в каталитическом центре имеют кофактор или кофермент.

Помимо активного центра ряд ферментов снабжен регуляторным (аллостерическим) центром. С этой зоной фермента взаимодействуют вещества, влияющие на его каталитическую активность.

Механизм действия ферментов

Акт катализа складывается из трех последовательных этапов.

1.      Образование фермент-субстратного комплекса при взаимодействии через активный центр.

2.      Связывание субстрата происходит в нескольких точках активного центра, что приводит к изменению структуры субстрата, его деформации за счет изменения энергии связей в молекуле. Это вторая стадия и называется она активацией субстрата. При этом происходит определенная химическая модификация субстрата и превращение его в новый продукт или продукты.

3.      В результате такого превращения новое вещество (продукт) утрачивает способность удерживаться в активном центре фермента и фермент-субстратный, вернее уже фермент-продуктный комплекс диссоциирует (распадается).

Виды каталитических реакций:

А+Е = АЕ = БЕ = Е + Б

А+Б +Е = АЕ+Б = АБЕ = АБ + Е

АБ+Е = АБЕ = А+Б+Е,   где Е – энзим, А и Б – субстраты, либо продукты реакции.

Ферментативные эффекторы – вещества, изменяющие скорость ферментативного катализа и регулирующие за счет этого метаболизм. Среди них различают ингибиторы – замедляющие скорость реакции и активаторы – ускоряющие ферментативную реакцию.

В зависимости от механизма торможения реакции различают конкурентные и неконкурентные ингибиторы. Строение молекулы конкурентного ингибитора сходно со структурой субстрата и совпадает с поверхностью активного центра как ключ с замком (или почти совпадает). Степень этого сходства может даже быть выше чем с субстратом.

Если А+Е = АЕ = БЕ = Е + Б , то      И+Е = ИЕ ¹

Концентрация способного к катализу фермента при этом снижается и скорость образование продуктов реакции резко падает (рис. 4.3.2.).

В качестве конкурентных ингибиторов выступает большое число химических веществ эндогенного и экзогенного происхождения (т.е. образующихся в организме и поступающих извне – ксенобиотики, соответственно).

Эндогенные вещества являются регуляторами метаболизма и называются антиметаболитами. Многие из них используют при лечении онкологических и микробных заболеваний, тк. они ингибируют ключевые метаболичекие реакции микроорганизмов (сульфаниламиды) и опухолевых клеток.

Но при избытке субстрата и малой концентрации конкурентного ингибитора его действие отменяется.

Второй вид ингибиторов – неконкурентные. Они взаимодействую с ферментом вне активного центра и избыток субстрата не влияет на их ингибирующую способность, как в случае с конкурентными ингибиторами.

Эти ингибиторы взаимодействуют или с определенными группами фермента (тяжелые металлы связываются с тиоловыми группами Цис) или чаще всего регуляторным центром, что снижает связывающую способность активного центра.

Собственно процесс ингибирования – это полное или частичное подавление активности фермента при сохранении его первичной и пространственной структуры.

Различают также обратимое и необратимое ингибирование. Необратимые ингибиторы инактивируют фермент, образуя с его АК или другими компонентами структуры химическую связь.

Обычно это ковалентная связь с одним из участков активного центра. Такой комплекс практически недиссоциирует в физиологических условиях.

В другом случае ингибитор нарушает конформационную структуру молекулы фермента – вызывает его денатурацию.

Действие обратимых ингибиторов может быть снято при переизбытке субстрата или под действием веществ, изменяющих химическую структуру ингибитора. Конкурентные и неконкурентные ингибиторы относятся в большинстве случаев к обратимым.

Помимо ингибиторов известны еще активаторы ферментативного катализа. Они:

1)      защищают молекулу фермента от инактивирующих воздействий,

2)      образуют с субстратом комплекс, который более активно связывается с активным центром Ф,

3)      взаимодействуя с ферментом, имеющим четвертичную структуру, разъединяют его субъединицы и тем самым открывают доступ субстрату к активному центру.

Распределение ферментов в организме

Ферменты, участвующие в синтезе белков, нуклеиновых кислот и ферменты энергетического обмена присутствуют во всех клетках организма. Но клетки, которые выполняют специальные функции содержат и специальные ферменты.

Так клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе содержат ферменты, катализирующие синтез гормонов инсулина и глюкагона. Ферменты, свойственные только клеткам определенных органов называют органоспецифическими: аргиназа и урокиназа – печень, кислая фосфатаза – простата.

По изменению концентрации таких ферментов в крови судят о наличии патологий в данных органах.

В клетке отдельные ферменты распределены по всей цитоплазме, другие встроены в мембраны митохондрий и эндоплазматического ретикулума, такие ферменты образуют компартменты, в которых происходят определенные, тесно связанные между собой этапы метаболизма. 

Многие ферменты образуются в клетках и секретируются в анатомические полости в неактивном состоянии – это проферменты. Часто в виде проферментов образуются протеолитические ферменты (расщепляющие белки). Затем под воздействием рН или других ферментов и субстратов происходит их химическая модификация и активный центр становится доступным для субстратов.

Существуют также изоферменты – ферменты, отличающиеся по молекулярной структуре, но выполняющие одинаковую функцию.

Номенклатура и классификация ферментов

Название фермента формируется из следующих частей:

1.      название субстрата с которым он взаимодействует

2.      характер катализируемой реакции

3.      наименование класса ферментов (но это необязательно)

4.      суффикс -аза-

пируват – декарбоксил – аза,  сукцинат – дегидроген – аза

Поскольку  уже известно порядка 3 тыс. ферментов их необходимо классифицировать. В настоящее время принята международная классификация ферментов, в основу которой положен тип катализируемой реакции. Выделяют 6 классов, которые в свою очередь делятся на ряд подклассов (в данной книге представлены только выборочно):

1.       Оксидоредуктазы. Катализируют окислительно-восстановительные реакции. Делятся на 17 подклассов. Все ферменты содержат небелковую часть в виде гема или производных витаминов В2, В5. Субстрат, подвергающийся окислению выступает как донор водорода.

1.1.  Дегидрогеназы отщепляют от одного субстрата водород и переносят на другие субстраты. Коферменты НАД, НАДФ, ФАД, ФМН. Они акцептируют на себе отщепленный ферментом водород превращаясь при этом в восстановленную форму (НАДН, НАДФН, ФАДН) и переносят к другому фермент-субстратному комплексу, где его и отдают.

1.2.  Оксидазы – катализирует перенос водорода на кислород с образованием воды или Н2О2. Ф. Цитохромокисдаза дыхательной цепи.

RH + NAD H + O2 = ROH + NAD + H2O

1.3.  Монооксидазы – цитохром Р450. По своему строению одновременно гемо- и флавопротеид. Он гидроксилирует липофильные ксенобиотики (по вышеописанному механизму).

1.4.  Пероксидазы и каталазы – катализируют разложение перекиси  водорода, которая образуется в ходе метаболических реакций.

1.5.  Оксигеназы – катализируют реакции присоединения кислорода к субстрату.

2.       Трансферазы – катализируют перенос различных радикалов от молекулы донора к молекуле акцептору.

Аа + Е + В = Еа + А + В = Е + Ва + А

2.1.  Метилтрансферазы (СН3-).

2.2.   Карбоксил- и карбамоилтрансферазы.

2.2.  Ацилтрансферазы – Кофермент А (перенос ацильной группы -R-С=О).

Пример: синтез нейромедиатора ацетилхолина (см.  главу “Обмен белков”).

2.3.  Гексозилтрансферазы  – катализируют перенос гликозильных остатков.

        Пример: отщепление молекулы глюкозы от гликогена под действием фосфорилазы.

2.4.  Аминотрансферазы – перенос аминогрупп

R1- CO – R2 + R1 – CH-NH3 – R2 = R1 – CH-NH3 – R2 + R1- CO – R2

Играют важную роль в превращении АК. Общим коферментом являнтся пиридоксальфосфат.

Пример: аланинаминотрансфераза (АлАТ): пируват + глутамат = аланин + альфа-кетоглутарат (см.  главу “Обмен белков”).

2.5.  Фосфотрансфереза (киназа) – катализируют перенос остатка фосфорной кислоты. В большинстве случает донором фосфата является АТФ. В процессе расщепления глюкозы в основном принимают участие ферменты этого класса.

        Пример: Гексо (глюко)киназа.

3.        Гидролазы – катализируют реакции гидролиза, т.е. расщепление веществ с присоединением по месту разрыва связи воды. К этому классу относятся преимущественно пищеварительные ферменты, они однокомпонентные (не содержат небелковой части)

R1-R2 +H2O = R1H + R2OH

3.1.        Эстеразы – расщепляют эфирные связи. Это большой подкласс ферментов, катализирующих гидролиз тиоловых эфиров, фосфоэфиров.
Пример: липаза.

3.2.  Гликозидазы – расщепляют гликозидные связи в молекулах поли- и олигосахаридов.

Пример: амилаза, сахараза, мальтаза.

3.3.  Пептидазы – катализируют гидролиз пептидных связей.

Пример: карбоксипептидаза, химотрипсин, трипсин.

3.5.  Амидазы – расщепляют амидные связи (СО-NH2).

Пример: аргиназа (цикл мочевины).

4.  Лиазы – катализируют реакции расщепления молекул без присоединения воды. Эти ферменты имеют небелковую часть в виде тиаминпирофосфата (В1) и пиридоксальфосфата (В6).

4.1.  Лиазы связи С-С. Их обычно называют декарбоксилазами.

Пример: пируватдекарбоксилаза.

4.2.  Лиазы связи (гидратазы-дегидратазы) С-О.

Пример:енолаза.

4.3.  Лиазы связи С-N.

4.4.  Лиазы связи С-S.

5.      Изомеразы – катализируют реакции изомеризации.

Пример: фосфопентозоизомераза, пентозофосфатизомераза(ферменты неокислительной ветви пентозофосфатного пути).

6.   Лигазы катализируют реакции синтеза более сложных веществ из простых. Такие реакции идут с затратой энергии АТФ. К названию таких ферментов прибавляют “синтетаза”.

ЛИТЕРАТУРА К ГЛАВЕ  IV.3.

1. Бышевский А. Ш., Терсенов О. А. Биохимия для врача // Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994, 384 с.;

2. Кнорре Д. Г., Мызина С. Д. Биологическая химия. – М.: Высш. шк. 1998, 479 с.;

3. Филиппович Ю. Б., Егорова Т. А., Севастьянова Г. А. Практикум по общей биохимии // М.: Просвящение, 1982, 311с.;

4. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки // М.: Мир, 1974, 956 с.;

5. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии // Ростов-на Дону: Феникс, 1999, 540 с.

Источник: http://test.kirensky.ru/books/book/biochemistry/chapter_03.htm

ПОИСК

Ферментативные реакции и действие некоторых эффекторов
    Применение метода Диксона к анализу нетривиальных типов ингибирования. Как отмечалось выше, обработка данных по влиянию ингибиторов на кинетику ферментативных реакций может быть проведена в, координатах Лайнуивера-Берка (1/ц, 1/[8]о) или, согласно методу Диксона, в координатах l v, [I]).

Метод Диксона обладает тем преимуществом, что он позволяет определять значение константы ингибирования непосредственно из кинетических данных, не прибегая к дополнительным построениям.

С другой стороны, вид графика в координатах Диксона не позволяет отличить смешанный тип ингибирования от конкурентного или неконкурентного ингибирования, как это обычно можно сделать при построении в координатах Лайнуивера-Берка. Однако [c.

82]

    В работе [10] изучали влияние н-бутаиола на-кинетику реакций гидролиза сложных эфиров, катализируемых карбокси-пептидазой В. На основании зависимости скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата (табл. 11) предложить кинетическую схему реакции (приняв двухстадийный механизм действия фермента) и определить константу ингибирования н-бутанолом. [c.91]

    В книге освещены наиболее важные аспекты ферментативной кинетики — способы вывода уравнений стационарной скорости, действие ингибиторов и активаторов на ферменты, кинетические механизмы ферментативных реакций, влияние pH и температуры на скорость ферментативных процессов, кинетические свойства аллостерических ферментов, интегральные формы кинетических уравнений, использование методов быстрой кинетики для исследования протекания ферментативных реакций и принципы статистической обработки данных кинетических измерений. [c.4]

    Обратим внимание, что образование промежуточного фермент-субстратного комплекса (комплекса Михаэлиса) само по себе вовсе не оказывает влияния на ускорение ферментативной реакции (в кинетическом режиме второго порядка, т. е. при [НУ] С Кз)- Дело в том, что концентрация стабилизированного пере- [c.40]

    Во второй части книги, посвященной ферментам, рассматриваются как традиционные вопросы биокинетики (уравнение Миха-элиса — Ментен, различные виды ингибирования, влияние pH на скорость ферментативных реакций и т, д.

), так и новые, не нашедшие пока отражения в учебной литературе (новые методы нахождения элементарных констант из данных стационарной кинетики, влияние диффузии на кинетику действия иммобилизованных ферментов, использование интегральных форм кинетических уравнений, кинетический анализ систем со взаимным истощением, анализ нетривиальных типов ингибирования, применение теории графов в ферментативной кинетике и др.). Требования систематизации курса способствовали созданию новых методов обработки кинетических данных ферментативных реакций, описываемых в главах 5—8, 10, 11. [c.4]

    Влияние обратимых эффекторов (ингибиторов и активаторов) на кинетику ферментативных реакций [c.79]

    Влияние обратимо действующего эффектора (Э) на двухстадийную ферментативную реакцию может быть передано следующей схемой, если полагать, что эффектор комплексуется с ферментом (или с фермент-субстратным комплексом) в соотношении 1 1  [c.219]

    В качестве иллюстрации смешанных типов ингибирования и активации ферментативных реакций можно привес+и данные по влиянию добавок н-бутанола на скорость реакций гидролиза сложноэфирного (рис.

79, а = 0,27, Р = 0) и пептидного (рис. 80, а = 0,2, Р = 2,3) субстратов карбоксипептидазой В, а также так называемое антиконкурентное (Р == О,/С = со,а/Сг з) влияние эффектора на катализ ацетилхолинэстеразой (рис. 81).

[c.224]

    ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА КИНЕТИКУ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ [c.249]

    Влияние pH на скорость ферментативных реакций [c.258]

    Внутримолекулярный кинетический режим способствует ускорению ферментативных реакций (см. гл. II). В связи с этим привлекают внимание исследования неферментативных внутримолекулярных реакций, где взаимодействующие функциональные группы ковалентно присоединены к одной молекуле.

Значительный интерес в этих исследованиях представляет сопоставление скоростей внутри- и соответствующих межмолекулярных реакций (для оценки эффекта сближения), а также выявление специфических факторов, оказывающих влияние на собственную (внутримолекулярную) реакционную способность присоединенных функциональных групп (их взаимное расположение — эффекты ориентации, влияние заместителей или микросреды и т. д.). [c.78]

    Бесконкурентная активация (а = Р > 1). В литературе описаны случаи, когда активатор увеличивает в одинаковой степени значения кат и Кт( ч х) (рис. 78). Подобный характер влияния эффектора соответствует бесконкурентному типу активации, и ферментативная реакция в этом случае описывается следующей схемой  [c.223]

    Влияние взаимозависимых неконкурентных ингибиторов на кинетические параметры ферментативной реакции. Кинетические параметры, характеризующие скорость реакции [c.229]

    Селективное влияние эффекторов (ингибиторов или активаторов) на стадию ацилирования.

Допустим, что в среду ферментативной реакции ввели эффектор, который селективно влияет на стадию ацили-рова”ния, что приводит к изменению эффективного значения константы скорости этой стадии.

Наблюдаемую в этом случае начальную стационарную скорость реакции (6.117), протекающей при [5]о [Е]о, запишем в виде  [c.244]

    Наконец, если в ходе ферментативной реакции фермент денатурирует по первому порядку с константой скорости инактивации и , причем субстрат не оказывает влияние на кинетику инактивации, то дифференциальное уравнение скорости ферментативной реакции можно записать в виде (при [S] [E]q) [c.258]

    В общем случае влияние обратимо действующих эффекторов на двухстадийную ферментативную реакцию может быть передано схемой (5.13). В этой схеме предусмотрено взаимодействие эффек- [c.79]

    Ферментативные реакции характеризуются также наличием колоколообразной зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком температурном интервале (что приводит к температурному оптимуму реакции).

Эта особенность влияния температуры на кинетику ферментативных реакций объясняется наложением двух эффектов — возрастанием скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при высоких температурах.

Ясно, что при достаточно корректной постановке эксперимента оба эти явления можно изучать раздельно (см., например, 9 этой главы). [c.266]

    Влияние температуры на реакции, катализируемые ферментами, по существу не отличается от влияния температуры на любые другие химические реакции. Поэтому методы обработки температурных зависимостей кинетических и равновесных параметров ферментативных реакций также основываются на классических принципах термодинамики и кинетики (см. гл. 4). [c.249]

    В таблице 15 приведены данные по влиянию профлавина на кинетические параметры гидролиза этилового эфира N-бензоил-глицина, катализируемого папаином [13].

Исходя из предположения о двухстадийном механизме ферментативной реакции, предложить кинетическую схему реакции папаина в присутствии профлавина и вычислить возможные кинетические и равновесные параметры реакции. [c.95]

    Из графика в координатах Лайнуивера-Берка (рис. 48) видно, что влияние катионов g + на ферментативную реакцию [c.106]

    Прочие типичные случаи отклонения кинетического поведения ферментативных реакций от уравнения Михаэлиса — Ментен (реакция двух субстратов с одним ферментом, реакция двух ферментов с одним субстратом, влияние примесей в препарате фермента на кинетику реакции т. д.) будут рассмотрены при решении соответствующих задач. [c.116]

    ВЛИЯНИЕ pH НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ [c.218]

    Рассмотрение первых двух процессов входит в круг вопросов, решаемых не физической химией, а гидродинамикой. Мы проанализируем здесь третью проблему, а именно влияние диффузии субстрата в гранулу иммобилизованного фермента на кинетические параметры ферментативной реакции. [c.268]

    На рис. 118 приведен график зависимости Р от а1. При Р отличается от единицы не более, чем на 10%, т. е. влиянием диффузии на кинетику ферментативной реакции практически можно пренебречь. При а1> величина Р заметно меньше единицы. Исходя из этого, отличие произведения а/ от единицы (в ту или иную сторону) может быть критерием влияния диффузии на [c.270]

    Влияние диффузии на скорость ферментативной реакции определяется диффузионным фактором F (см. 3 настоящей главы), для уменьшения которого необходимо уменьшить величину al (см. рис. 118), где  [c.280]

    Влияние взаимонезависимых конкурентных ингибиторов на кинетические параметры ферментативной реакции. Влияние двух взаимонё-зависимых конкурентных ингибиторов на двухстадийную ферментатив- [c.228]

    Не менее важным структурным элементом молекулы субстрата является и а-ациламидная группа. Этот субстратный фрагмент не оказывает заметного влияния на свободную энергию образования комплекса Михаэлиса, однако, как видно из табл.

28, наличие его в молекуле сложного эфира приводит к существенному ускорению последующих химических стадий ферментативной реакции и обусловливает также стереоспецифичность катализа по отношению к -энантиомерам. [c.

134]

    З-образный характер зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в катализе химотрипсином.

Изменение среды в результате добавки органических соединений также оказывает заметное влияние на эффективность сорбции на активном центре химотрипсина гидрофобных компонентов реакции.

Причина этого заключается, как правило, в том, что органическая добавка, повышая растворимость субстрата (или субстратоподобного ингибитора) в воде, удерживает его в водном растворе и затрудняет тем самым [c.145]

    Из выражений (6.33) и (6.

34) видно, что положение точки, в которой происходит пересечение пучка прямых, соответствук)щих зависимости 1/у от 1/[8]о при различных концентрациях эффектора, определяется лишь значениями констант а и Р и не зависит от величины Кэ (схема 6.14).

Таким образом, вид графика в координатах Лайнуивера — Бёрка может быть использован для определения типа влияния эффектора на ферментативную реакцию и для оценки интервалов значений а и Р (более подробно см. в [61). [c.224]

    Влияние взаимозависимых конкурентных ингибиторов на кинетические параметры ферментативной реакции. Схема двухстадийной [c.227]

    Влияние взаимонезависимых неконкурентных ингибиторов на кинетические параметры ферментативной реакции. В присутствии двух взаимонезависимых неконкурентных ингибиторов схема двухстадийной ферментативной реакции принимает вид [c.230]

    При изучении кинетики ферментативных реакций, протекающих до высоких степеней превращения субстрата, необходимо учитывать возможную инактивацию фермента в ходе реакции.

В ряде случаев было найдено, что связывание субстрата с ферментом ускоряет инактивацию последнего в некоторых случаях субстрат не оказывает влияние на инактивацию фермента. Однако чаще всего связывание субстрата предохраняет фермент от инактивации, т. е.

ферментсубстрат-ный комплекс инактивируется медленнее, чем свободный фермент. [c.254]

    В целом функциональный характер рН-зависимых кинетических пара метров уравнения Михаэлиса обнаруживает глубокое сходство с закономерностями рассмотренного обратимого влияния э( к )екторов (см. 2 этой главы).

Так, например, если при связывании субстрата ( )ерментом константы диссоциации ионогенных групп не претерпевают изменений (т. е. Ка = К в.

, Кв = К или, что то же самое, ионогенный процесс не оказывает влияния на сорбцию субстрата и, следовательно, К = К/ = К ), то величина наблюдаемой константы Михаэлиса ферментативной реакции не зависит от pH (/Ст(каж) = KsУ  [c.260]

    В данном случае можно провести аналогию ионогенного процесса с конкурентным влиянием эффектора на кинетику ферментативной реакции, поскольку зависимость от pH обнаруживает лищь эффективное [c.261]

    Настоящее пособие — первое в мировой литературе учебное руководство по анализу и обработке кинетических данных ферментативных реакций.

В первой части курса наложены методы анализа кинетических закономерностей простых химических реакций, изуче-иие их необходимо для дальнейшего понимания кинетики и механизма действия ферментов.

Во второй части книги рассмотрены методы обработки кинетических данных ферментативных реакций-Особое внимание здесь уделено новым- подходам, не нашедшим до последнего времени отражения в учебной литературе (новые методы нахождения элементарных констант, влияние диффузии на кинетику действия иммобилизованных ферментов, использование интегральных форм кинетических уравнений и др.). Каждая глава сопровождается О ригинальными задачами с подробными решениями. [c.2]

    Воспользуемся критерием Тиле (12.43). Так как концентрация субстрата неизвестна, примем, что отношение и/[3]о равно кат [Е] о//(т(каж) (преувеличивая этим влияние диффузии на скорость ферментативной реакции).

Подставляя численные значения параметров в соотношение (12.43), находим Ф = 0,0035. Так как рассчитанная величина модуля Тиле является намного меньшей единицы, то диффузия практичеоки не оказывает влияния на изучаемый ферментативный процесс.

[c.283]

Источник: https://www.chem21.info/info/902784/

Ферментативные реакции и действие некоторых эффекторов

Ферментативные реакции и действие некоторых эффекторов

Считается, что все реакции живого требуют участия фермента, даже такие простые, как гидратация диоксида углерода и его выделение из угольной кислоты. Всего в настоящее время охарактеризовано свыше 20 тыс. ферментов.

Многие из них синтезируются в живых организмах в нескольких вариантах, различающихся особенностями строения участков, непосредственно не участвующих в каталитическом процессе. Их называют изоферментами.

Наличие изоферментов, объясняемое законами биохимической эволюции, обусловливает важное приспособление, способствующее сохранению биохимической функции при изменении условий существования организма. Изоферменты несколько отличаются друг от друга по таким параметрам, как сродство к субстрату, pH-оптимум активности, чувствительность к физическим и химическим факторам среды.

Для каждого фермента существует свой субстрат. Механизм осуществления ферментативной реакции преобразования субстрата в целом подобен любому катализу. Его можно представить в виде совокупности стадий, включающих образование одного или нескольких промежуточных соединений, энергия активации которого ниже, чем энергия активации некаталитизируемой реакции:

(2.1)

Здесь Е — традиционное обозначение фермента (от «энзим»); Е—S — фермент-субстратный комплекс; Р,, Р2 — продукты превращения субстрата. Число промежуточных комплексов обычно составляет два, хотя есть примеры и более сложных реакций.

Некоторые из фермент-субстратных комплексов были исследованы современными инструментальными методами анализа, для них были установлены геометрия связей фермента и субстрата, а также термодинамические параметры образования и последующего превращения. Как и любой другой катализатор, фермент не меняет положения равновесия реакции превращения субстрата.

Природа пошла по другому пути: формально обратимые реакции в живых организмах идут в прямом и обратном направлениях через различныепромежуточные продукты и катализируются разными ферментами. Это позволяет обойти требования термодинамики и смешать выход целевого продукта против градиента его термодинамического потенциала.

Энергию для этого дают метаболические процессы окисления (для большинства современных живых организмов), конвертирующие энергию химических связей в универсальный переносчик энергии — АТФ. Главное, что отличает ферментативный катализ от любого другого, — это сверхвысокая эффективность и специфичность.

Ферменты увеличивают скорость реакций в десятки тысяч и миллионы раз, причем делают это в достаточно узком интервале температур и значений pH, соответствующем условиям существования живых организмов.

Для объяснения столь высокой эффективности катализа были разработаны две концепции, получившие названия концепции комплементарности («ключ—замок») и концепции индуцированного соответствия.

Концепция «ключ—замок» предполагает наличие в трехмерной структуре белка определенных функциональных групп, которые стерически точно соответствуют функциональным группам субстрата. Благодаря этому субстрат входит в структуру белка подобно тому, как ключ входит в скважину замка.

Последующие взаимодействия меняют структуру субстрата, что облетает его дальнейшее превращение. Поскольку продукт превращения уже не обладает комплементарным строением, он удаляется из белка, который, таким образом, освобождается для превращения следующего субстрата. Концепция «ключ—замок» хорошо объясняет способность ферментов катализировать превращение строго определенного субстрата. Например, такие ферменты, как глюкозооксидаза или уре- аза, катализируют превращение строго определенного соединения (окисление глюкозы и гидролиз мочевины), и даже незначительное изменение его структуры снижает эффективность катализа в тысячи раз. Совокупность групп, участвующих в связывании субстрата, получила название активного центра фермента. Активный центр для большинства ферментов установлен. В его роли помимо аминокислотных групп белка также могут выступать некоторые небелковые небольшие молекулы, которые включены за счет многоточечных взаимодействий в структуру белковой части (апофер- мента). Их называют кофакторами. Наиболее известными кофакторами являются NADH (никотинамидадениндинуклеотид, содержащийся в более чем 250 ферментах), его фосфат NADPH, PQQ (пирролохинолинхинон) и FADH2 (флавинадениндинуклеотид). В качестве кофакторов могут выступать ионы металлов или комплексы (металлокофакторы):

Впоследствии теория комплементарности была несколько трансформирована. Она не объясняла существования ферментов, катализирующих превращение целой группы субстратов, в том числе структурно различающихся. Например, пероксидаза катализирует окисление ароматических спиртов, аминов, ряда алифатических соединений под действием пероксида водорода. Тирозиназа катализирует окисление широкой группы замещенных фенолов, аминооксидаза — первичных и вторичных алифатических аминов биогенного происхождения. Было высказано предположение, позднее подтвердившееся, что активный центр фермента не имеет предопределенного строения. Субстрат, приближаясь к молекуле белка, сам формирует необходимое для реакции положение функциональных групп белка. т Концепция индуцированного соответствия хорошо объясняет групповую специфичность ферментов и закономерности изменения активности катализатора в группе структурно родственных субстратов. В соответствии с ней образованию фермент-субстратного комплекса предшествует формирование комплекса включения, в котором еще отсутствуют ковалентные связи между ферментом и субстратом. Именно на этом этапе формируется активный центр, подтягиваются к молекуле субстрата необходимые функциональные группы. Существуют даже ферменты, для которых наличие определенного в пространстве активного центра ставится под сомнение. Например, фермент ацетилхолинэстераза (ChE), один из самых активных, по формальным кинетическим расчетам должен обладать более чем 200 активными центрами в расчете на одну молекулу. В настоящее время предполагается, что реакция гидролиза субстрата ацетилхо- линэсгеразы — ацетилхолина — проходит в два этапа. Сначала субстрат втягивается в особую складку на поверхности белковой глобулы под действием значительного градиента электростатического поля. Стенки складки устланы остатками ароматических аминокислот, что облегчает движение субстрата, а на дне ее происходит взаимодействие ацетилхолина с остатками серина и фенилаланина, собственно определяющее дальнейший распад ацетилхолина на холин и ацетат-ион.

(2.2)

Понятие специфичности ферментативного катализа трактуют двояко: специфичность по отношению к определенному субстрату или группе субстратов, о чем речь шла выше, и специфичность по отношению к типу катализируемой реакции. Как правило (есть исключения), фермент катализирует только один тип превращения субстрата.

По этому признаку все ферменты разделяются на шесть классов (табл. 2.1). В ферментативном анализе применяют практически исключительно ферменты классов 1 (оксидоредуктазы) и 3 (гидролазы). Количество фермента выражают не так, как принято в классическом химическом анализе.

Поскольку действующие концентрации ферментов очень малы (они могут составлять нано- и пикомоли), а выделять их в чистом виде — достаточно дорогая и не всегда возможная процедура, используют единицы активности фермента Е (в английском языке «U»).

Это количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в единицу времени (обычно в минуту) в оптимальных условиях.

Производные единицы — удельные активности, выражающие, скольким единицам активности соответствует один грамм (миллиграмм) или один мил- Классификация ферментов в соответствии с типом катализируемой реакции

Класс ферментаТип катализируемой реакции
1.

Оксидоредуктазы

Перенос электрона
2.ТрансферазыПеренос групп
3. ГидролазыГидролиз
4. ЛиазыПрисоединение к двойным связям и обратные реакции
5. ИзомеразыИзомеризация
6.

Лигазы (синтазы)

Образование связей С-С, С-Х с участием АТФ

лилитр раствора. Фирма — производитель ферментного препарата указывает, в каких условиях определяется его активность. Кроме того используют понятие «число оборота».

Оно показывает, сколько молекул субстрата превращается в расчете на одну молекулу фермента (точнее, один активный центр) в единицу времени. Таким же образом можно оценить эффективность ферментсодержащего препарата — гомогената ткани (инертного носителя, содержащего фермент). Природа фермента и условия проведения ферментативной реакции определяют и другие кинетические параметры реакции. Их установление предполагает априорное задание последовательности отдельных стадий. Наиболее распространенной (хотя и не верной с точки зрения механизма реакции) является так называемая кинетика Михаэлиса— Ментен, допускающая двухстадийный характер реакции превращения субстрата.

(2.3)

Для концентрации субстрата, превосходящей концентрацию фермента, скорость накопления продукта Р, называемая также общей скоростью ферментативной реакции, выражается соотношением
где— максимальная скорость ферментативной реакции;
— константа Михаэлиса, имеющая размерность
концентрации;— концентрации субстрата и фермента (активного центра) соответственно. Константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от макси- мально возможной для данной концентрации фермента. Для ферментативного анализа константа Михаэлиса важна и потому, что она определяет минимальную концентрацию субстрата, которую можно определить с помощью данного фермента. При этом, правда, речь идет о гомогенной реакции, не учитывающей синергетические и регуляторные реакции, осуществляемые в живом организме для тонкой регуляции биохимических циклов. Для этого большинство ферментов имеют так называемые аллостерические центры. Это определенная совокупность функциональных групп, которая не совпадает с активным центром фермента, но воздействие на которые меняет сродство фермента к субстрату. Вещества, взаимодействующие с аллостерическими центрами, называются аллостерическими регуляторами. К ним могут относиться сами субстраты, продукты их ферментативного превращения, низкомолекулярные органические соединения — промежуточные продукты метаболизма. Распространенными аллостерическими регуляторами являются катионы металлов. Хотя кинетика Михаэлиса—Ментен не соответствует механизму превращения большинства известных фермент-субстратных систем, ее и вытекающие из нее понятия активно применяют в кинетическом анализе реальных ферментативных реакций. Это связано с тем, что многие дополнительные стадии, не вошедшие в «классический» механизм, не являются скоростьопределяющими, поскольку включают кислород (для оксидоредуктаз) или воду (для гидролаз), которые присутствуют в реакционной среде в большом избытке. С другой стороны, кинетика Михаэлиса—Ментен позволяет просто находить основные кинетические параметры. С некоторыми допущениями их используют и для более сложных процессов, меняя кинетические параметры, входящие в состав константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции. При этом оговаривают условия, для которых соответствующие значения будут корректными. К таким оговариваемым условиям относятся абсолютные концентрации субстрата и фермента или их соотношение. Не углубляясь в кинетический анализ сложных ферментативных процессов, рассмотрим кратко основные методы определения кинетических параметров процесса по уравнению Михаэлиса—Ментен. На рис. 2.2, а представлена зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. На практике для измерений используют начальную скорость реакции, которую находят, аппроксимируя кинетическую кривую накопления продукта (или расходования субстрата) на момент времени t = 0. Использование именно начальной скорости v0 объясняется несколькими причинами, среди которых — возможность использования в расчетах начальной концентрации субстрата, которую можно определить значительно точнее, чем текущую концентрацию на момент времени /. Поскольку зависимость в целом имеет нелинейный характер, для определения кинетических параметров ее преобразуют к другим координатам. Получаемые при этом кривые называют анаморфозами кинетической зависимости. На рис. 2.2, б показан один из наиболее распространенных примеров анаморфозы, полученный по методу Лайнуивера—Берка, называемый также методом двойных обратных координат. В его основе лежит аналитическое представление уравнения Михаэлиса—Ментен (2.4) в следующей форме:

(2.5)

В соответствии с уравнением (2.5), зависимость 1/v от \/С$ представляет собой прямую линию, тангенс угла наклона которой равен Km/Vmax’ а отРезокэ отсекаемый ею на оси координат составляет l/vmax* Если продолжить эту прямую до пересечения с осью абсцисс, то отсекаемый ею отрезок будет равен 1 /Кт. Метод двойных обратных координат дает непропорциональное распределение точек на прямой, полученное при пропорциональном варьировании концентрации субстрата. При этом точки, наиболее удаленные от начала координат, соответствуют измерениям с минимальными концентрациями субстрата, а значит, могут быть определены с наименьшей точностью. Это приводит к достаточно большим погрешностям оценки кинетических параметров. Поэтому были разработаны другие, пропорциональные шкалы линеаризации, некоторые из которых приведены в табл. 2.2. Для тех же результатов измерений они дают более точные оценки /vmax. Поскольку все представленные методы базируются на одном и том же уравнении Михаэлиса—Ментен, результаты определения кинетических параметров должны для них совпадать. Эго утверждение часто используется для обратного контроля справедливости допущения о механизме ферментативной ре- Рис. 2.2. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (а) и представлениезависимости в двойных обратных координатах (метод Лайнуивера-Берка) (б) Способы представления кинетических данных ферментативного катализа и определения кинетических параметров по анаморфозам кинетической зависимости

МетодСпособ линеаризации зависимости в координатах (х – у)Тангенс угла наклона линейной зависимостиОтрезки; отсекаемые на оси абсциссОтрезки, отсекаемые на оси ординат
Лайнуивера-Берка1/Cj- 1/v-vxm 1Л'

max

Иди-Хофстиv-v/Cs-У“тVmaxmax m
ХейнсаCs-CJv

ш

К N V m»x

акции. Если оценки кинетических параметров, сделанные различными методами, совпадают с точностью до погрешности определения, то допущение о том что реакция подчиняется кинетике Михаэлиса—Ментен, справедливо. Ряд ферментативных реакций не подчиняется кинетике Михаэлиса—Ментен. Причины этого могут быть разными. К наиболее существенным относятся другая стехиометрия взаимодействия (связывание двух молекул субстрата одним активным центром), наличие изоферментов, отличающихся по активности в отношении субстрата, аллостерические взаимодействия с участием субстрата или продукта его превращения, которые приводят к снижению скорости реакции (ингибирование избытком субстрата/продукта) или ее увеличению (активация фермента избытком субстрата/продукта). Также следует отметить, что гетерогенные условия функционирования фермента в ряде случаев накладывают свои ограничения на кинетику взаимодействия фермента и субстрата. Эти ограничения связаны с диффузионным контролем поступления субстрата в зону реакции и со специфическими взаимодействиями компонентов реакции с носителем (электростатическое или гидрофобное взаимодействие субстрата, наличие каналов проводимости в биологических мембранах, пространственное сближение активных центров в полиферментных комплексах и т.д.). Ферментативный анализ в современном понимании направлен на решение двух проблем, связанных с биомедицинскими и экоток- сикологическими исследованиями, это определение: присутствия и уровня активности конкретных ферментов; субстратов и эффекторов ферментов. Решение первой задачи необходимо при установлении бактериального загрязнения продуктов питания, обсемененности открытых ран, при диагностике ряда заболеваний и интоксикаций, связанных с производством избыточных количеств фермента. Вторая задача связана с поиском и количественной оценкой присутствия субстратов и эффекторов ферментов, обладающих токсичными свойствами, т.е. с решением собственно задачи химической безопасности. Решение обеих задач связано с осуществлением ферментативного превращения субстрата в строго контролируемых условиях и определением скорости реакции по характеристическим изменениям физико-химических свойств среды. Таким образом, ферментативный анализ является частным случаем кинетического анализа. Количественное определение субстрата или фермента основано на факте, что скорость ферментативной реакции остается пропорциональной концентрации субстрата в области малых его превращений. Это условие справедливо в двух случаях: если кинетика реакции подчиняется уравнению Михаэлиса—Ментен и если степень превращения субстрата на момент измерения не превышает 30%. Поскольку точное измерение скорости является достаточно сложным с методической точки зрения экспериментом, в анализе чаще используют упрощенные подходы, получившие название метода постоянного времени или метода постоянной концентрации. В первом случае проводят измерение концентрации продукта или свойства, с ней связанного (оптической плотности раствора, сдвига pH, электропроводности, выделяющейся теплоты, уровня люминесценции), в момент времени, отвечающий начальному линейному участку кинетической кривой. Во втором случае производится измерение времени, необходимого для достижения заданной степени превращения субстрата. Например, если реакция сопряжена с образованием или расходованием окрашенного продукта, то измеряется время появления (изменения, исчезновения) характерной окраски. Поскольку все ферментативные реакции меняют pH раствора, для этого достаточно, например, добавить специально подобранный pH-индикатор, но чаше для повышения точности и специфичности анализа применяют хромогенные субстраты. Такой подход используют, например, при изготовлении индикаторной бумаги, пропитанной ферментом и специальными прокрашивающими реагентами. Их используют, в частности, при измерении уровня глюкозы в крови и моче. Вариацией метода является линейно-колориметрический способ измерения, когда определяют длину окрашенного участка сорбента, несущего соответствующий фермент. Помимо измерения степени окрашивания, визуального или спектрофотометрического, в ферментативном анализе применяются практически все способы регистрации сигнала инструментального анализа — флуоресцентный, энтальпиеметрический, электрохимический, пьезометрический и др. Соответствующие средства измерения, сочетающие датчик и биологический распознающий компонент — источник ферментативной активности — называют биосен-

сорамиу схема формирования отклика которых была приведена на рис. 2.1. 

Источник: https://bookucheba.com/himicheskaya-zaschita-radiatsionnaya/fermentativnyie-reaktsii-deystvie-nekotoryih-65475.html

Book for ucheba
Добавить комментарий