Классификация методов иммунохимического анализа

2. Общая характеристика иммунохимического метода анализа

Классификация методов иммунохимического анализа

СОДЕРЖАНИЕ:

1.Введение……………………………………………………………………………3

2.Общая характеристика иммунохимическихметодов анализа………………………

3.Структура и свойства антигенов иантител…………………….

4.Физико-химические взаимодействияантиген – антитело………………………………….

5.Иммуноферментный анализ(ИФА)……………………………………………………

5.1Сущность и классификация иммуноферментногоанализа………………………………

5.2Характеристика компонентов, используемыхв ИФА…………………………..

5.3Гетерогенные методы иммуноферментногоанализа…………………………………………..

5.4Гомогенные методы иммуноферментногоанализа……………………….

5.5«Сендвич» – вариант ИФА для выявленияантигенов……………………………………………….

5.6Ингибиторный иммуноферментныйанализ………………………………………………….

5.7Практическое применениеИФА……………………………………………………..

6.Иммунофлюоресцентный анализ………………………………..

7.Радиоиммунологическийметод анализа………………………………………………

8.Иммуноцитохимический и иммуногистохимическийанализ………………………….

9.Заключение………………………………………………………

Введение:

Иммунохимическиеметоды анализа, основанные на специфическомсвязывании определяемого соединениясоответствующими антителами, широковошли в аналитическую практику ииспользуются в различных областяхмедицины, сельского хозяйства,микробиологической и пищевойпромышленности, для целей охраныокружающей среды. Индикация образующегосякомплекса антиген-антитело может бытьосуществлена, если в один из исходныхкомпонентов реакционной системы ввестиметку, которая легко детектируетсясоответствующим высокочувствительнымфизико-химическим методом. Весьмаудобными для этой цели оказалисьизотопные, ферментные, флуоресцентные,парамагнитные и др. метки, использованиекоторых дало возможность увеличитьчувствительность классическихиммунохимических методов анализа вмиллионы раз, а время анлиза уменьшитьдо нескольких минут.

Историческипервым среди них был радиоиммунологическийанализ (РИА), предложенный в конце 50-хгодов прошлого века. Благодаря возможностиопределять метку, которой являлся изотоп125I,в очень малых концентрациях, удалосьдостигнуть высокой чувствительностианализа (на уровне пкг/мл).

В середине60-х годов для идентификации и локализацииантигенов в гистохимических препаратахи выявления полос преципитации виммунодиффузных и иммуноэлектрофоретическихметодах в качестве высокочувствительнойметки было предложено использоватьмолекулы ферментов.

Являясь по своейприроде мощными химическими катализаторами,ферменты способны эффективно осуществлятьнаработку легко детектируемого продукта,что делает возможным определениеферментной метки в весьма малыхконцентрациях (до 10-12М и ниже).

На протяжении последних трехдесятилетий иммуноферментные методыанализа интенсивно развивались как втеоретическом, так и практическом планеи к настоящему времени они сформировалисьв самостоятельное научное направление,имеющее важное прикладное значение.

Наибольшее распространение получилигетерогенные методы иммуноферментногоанализа, основанные на использованииполистирольных планшетов для иммобилизацииантител или антигенов, специфическомсвязывании определяемого вещества настенках лунок планшета и последующемвыявлении образовавшихся иммунокомплексовс помощью меченных ферментами компонентов.

В основе иммунохимическихметодов анализа лежит высокоспецифичнаяи высокочувствительная иммунная реакцияантигена с антителами. Антитела – этобелки класса иммуноглобулинов, которыевырабатываются в имунной системе врезультате проявления защитной функции(иммунитета) при попадании в организмчужеродного вещества – антигена.

Достоинства метода:

·       Быстрота ипростота определения;

·       Возможностьавтоматизации и использования длямассовых анализов в полевых условиях;

·       Не сложнаяпробоподготовка;

·       Высокаяточность;

·       Не требуетсядорогостоящей аппаратуры.

Недостатками можноназвать узкую специфичность и влияниекомпонентов матрицы.

Метод применяетсядля обнаружения вирусов, гормонов,лекарственных препаратов, определениябиологически активных веществ.

Для определениямоновалентных антигенов используетсяконкурентная схема – в систему водятсямеченые ферментом вещества, которыеконкурируют с антигеном при взаимодействиис ограниченным числом центров связыванияспецифичных антител.

Существует дваспособа реализации иммунохимическогоанализа – прямой и непрямой.

Прямой способ.Антитела нанесены на твердую фазу,ферментная метка вводится в антиген.Преимущества – небольшое число стадийи, соответственно, возможностьавтоматизации определения. Недостатоки– сложность и неуниверсальность методовсинтеза ферментных коньюгатов(промежуточная стадия имунной реакции),а также возможное влияние компонентовобразца на активность фермента

Непрямой способ.Антиген наносится на твердую фазу,ферментной меткой отмечаются вторичныеантитела, полученные против иммуноглобулиновсоответствующего типа. Достоиствомэтого способа является возможностьустранения влияний различных эффектовна каталитические свойства ферментов.

На основеиммуннохимического метода  созданомножество тест-систем. Они реализуютсяобычно на микропланшетах или в пробирках.С помощью тест-систем определяютсягормоны и лекарства в сыворотке крови.Кроме того, на основе имунной реакциисоздаются биосенсоры.

3. Структура и свойства антигенов и антител

Генетическичужеродные вещества, попадая в организмвысших животных и человека, способнывызывать в них ряд специфическихпроцессов, направленных на их удалениеиз организма.

Система организма,выполняющая эту функцию, называетсяиммуннойсистемой,а сами процессы – иммунологическими.К важнейшим из них следует отнестиобразование специфических белков крови– антител(иммуноглобулинов).

Вещества, способные вызывать специфическиеиммунологические реакции в организме,получили название антигенов.Способность антигенов вызывать иммунныйответ называется иммуногенностью,а способность образовывать комплексыс антителами – антигенностью.

К антигенам относятся белки, полисахариды,нуклеиновые кислоты как в очищенномвиде, так и в виде компонентов различныхбиологических структур (клеток, тканей,вирусов и т.д.).

Наповерхности молекулы сложного антигенаможно выявить функциональные группыили остатки, обуславливающие антигеннуюспецифичность,называемые антигеннымидетерминантамиили эпитопами.Число эпитопов на поверхности сложноймолекулы определяет валентностьантигена.

Понятие антигенная детерминантавключает в себя последовательностьобразующих ее химических функциональныхгрупп и их пространственное расположение.В молекулах белков антигенная детерминантаобразуется совокупностью аминокислотныхостатков ( может варьировать от 5 до 20).Антигенные детериминанты белков бываютдвух типов – секвенциальные,т.е.

представляющие собой последовательностьаминокислотных остатков в полипептиднойцепи, и конформационные,образованные аминокислотными остаткамииз различных частей белковой глобулы.

Во многих случаях единичная заменааминокислоты в структуре антигеннойдетерминанты или изменение конформациибелковой глобулы являются достаточнымидля изменений антигенной специфичностимакромолекулы. Если два антигена имеюттолько часть одинаковых антигенныхдетерминант, их называют перекрестнореагирующими антигенами.

Низкомолекулярныевещества, не способные сами вызыватьобразование антител, но приобретающиеиммуногенные свойства после конъюгированияс высокомолекулярными носителями,например, бычьим сывороточным альбумином,называются гаптенами. К гаптенам относится широкий кругприродных соединений: пептидные истероидные гормоны, различные лекарственныепрепараты, антибиотики, витамины,олигосахариды и т.д.

Биологическаяфункция антител заключается в защитеорганизма от проникновения чужеродныхвеществ путем образования прочныхспецифических иммунных комплексов ссоответствующими антигенами и последующегоудаления их из организма. Способностьантител образовывать высокоспецифичныепрочные иммунокомплексы с различнымивеществами и возможность полученияантител в необходимых количествахявляются основой иммунохимическихметодов анализа.

Ворганизме антитела вырабатываютсяспецифическими клетками крови –В-лимфоцитами,каждый из которых имеет на своейповерхности до 100 000 рецепторов одинаковойспецифичности, способных узнавать любойчужеродный антиген.

Антиген, встречаясьв кровотоке с комплементарным емурецептором, проводит отбор (селекцию)соответствующего В-лимфоцита, которыйзатем, трансформируясь в плазматическуюклеткуи многократно делясь, образует клонклеток. Каждый клон плазматическихклеток секретирует гомогенные по своейструктуре антитела.

Однако так какантиген активирует в крови сразу большоеколичество типов В-лимфоцитов, которыесодержат рецепторы различной степениспецифичности по отношению к исходномуантигену, такой иммунный ответ и антителаназываются поликлональными.

Сыворотку животного, содержащуюспецифические к данному антигенуантитела, называют антисывороткой,при этом обычно указывают против какогоантигена и каким животным она выработана(например, антисыворотка кролика противэритроцитов человека).

Принципиальноважным является то, что поликлональныеантитела даже против одной-единственнойантигенной детерминанты гетерогенныкак по структуре активного центра, таки по физико-химическим свойствам. В томслучае, если антиген поливалентен,например, белок, то в сыворотке кровиобразуются антитела, направленныепротив каждой индивидуальной антигенной детерминанты, что еще более усложняетсостав антител.

Всередине 70-х годов был разработанпринципиально новый путь полученияантител, основанный на слиянии(гибридизации) лимфоцитов иммунизированногоживотного с миеломными клетками собразованием новых клеток – гибридом.

Особенностью таких клеток является ихспособность размножаться и продуцироватьантитела в искусственных условиях внеорганизма.

С помощью специальных методовклонирования можно выделить однугибридную клетку, которая, размножаясь,будет секретировать в неограниченныхколичествах антитела только одноговида – моноклональныеантитела,которые являются гомогенными как поспецифичности, так и по физико-химическимсвойствам.

Структураантител.Иммуноглобулины по своей химическойструктуре относятся к большому классуприродных соединений – гликопротеидам,т.е. белкам, содержащим в своей структуреолигосахариды. Несмотря на огромноеразнообразие антител и их гетерогенность,все они обладают некоторыми общимиструктурными элементами, обеспечивающимивыполнение их основных функций.

Посвоим антигенным, эффекторным сфвойствами структурным особенностям иммуноглобулиныподразделяются на пять основных классов:IgA,IgD,IgE,IgGи IgM(Igобозначает иммуноглобулин).

Общейструктурной единицей всех иммуноглобулиновявляется комплекс из четырех полипептидныхцепей – двух идентичных между собойлегкихцепей с молекулярной массой 23 кД каждая( L-цепи,от английского слова light-легкий) и тяжелыхс молекулярной массой по 53000 (Н-цепи, отанглийского heavy-тяжелый).

Каждая из легких цепей прочносоединена с NH2-концевымиучастками тяжелых цепей благодаряналичию межцепочечных дисульфидныхсвязей и множеству слабых гидрофобных,электростатических и других межатомныхвзаимодействий. Аналогичные связисуществуют и между свободными участкамитяжелых цепей.

В целом структура такогокомплекса напоминает латинскую буквуY(или Т) и характерна для иммуноглобулиновклассов IgG,IgD,и IgE(рис.1).

Рис.1.Пространственная структура молекулыIgG

Придействии протеолитического ферментапапаина молекула IgG распадается на три фрагмента, два изкоторых идентичны и сохраняют способностьсвязывать антигены (так называемыеFab-фрагменты)и третий, способный к кристаллизации(Fc-фрагмент),отвечающий за эффекторную функциюантител (Рис.2).

Другой протеолитическийфермент пепсин разрывает пептиднуюсвязь, расположенную ближе к СООН-концуцепи от S-Sсвязи между Н-цепями в Fc-фрагменте.

В результате образуются так называемыйрFc’-фрагмент,представляющий остатки тяжелых цепейи соединенные дисульфидными связямидва Fab-фрагмента,обозначаемые как F(ab’)2-фрагмент.

Рис.2.Схематическое изображение структурымолекулы IgG.

Антигенсвязывающийцентррасположен в NH2-концевыхчастях Н- и L-цепей.Таким образом каждая молекула IgG,а также F(ab’)2-фрагментысодержат по два одинаковых антигенсвязывающихцентра, а Fab-фрагмент– один.

Молекулыантител имеют большое число S-S–связей, которые можно разделить на 3категории – межцепочечные, внутрицепочечныеи связи между Н-цепями отдельныхчетырехцепочечных комплексов,обусловливающих образование полимерныхмолекул – IgMи IgА.

Структура иммуноглобулинов различныхклассов обусловлена числом и расположениеS-Sсвязей в молекулах, а также количествомчетырехцепочечных элементов. IgМприсутствует в сыворотке в виде пентамерачетырехцепочечных комплексов, соединенныхS-Sсвязями между Н-цепями.

Некотороеколичество IgАсыворотки также присутствует в видедимерной и тетрамерной формы (Рис. 3).

Рис.3.Схематическое изображение структурымолекул иммуноглобулинов различныхклассов 

Легкиецепи иммуноглобулинов бывают толькодвух типов – lили c,и являются общими для всех пяти классов,в то время как тяжелые цепи обладаютструктурными, иммунологическими ихимическими особенностями, характернымидля каждого класса иммуноглобулинов.При исследовании аминокислотнойпоследовательности было обнаружено,что все легкие и тяжелые цепи имеют однупринципиальную структурную особенность:они состоят из двух частей – вариабельной(V)и константной(С) (Рис.4).

Рис.4.Схематическое изображение расположенияконстантых и вариабельных участков вмолекуле IgG.

Постояннаяили константная часть легких цепей (СL)включает 107 аминокислотных остатковСООН-концевого участка, константнаячасть тяжелой цепи приблизительно втри раза (или в четыре в случае IgMи IgA)длиннее вариабельной.

Оставшиесяпоследовательности аминокислотныхостатков в NH2-концевойполовине легких и тяжелых цепей образуеттак называемые вариабельные области(VCи VH).В каждой из легких цепей молекул антителсуществуют две внутрицепочечныедисульфидные связи, число такх связейв тяжелых цепях различно (4-6).

Каждый извнутрицепочченых дисульфидных мостиковобразует петлю из 55-70 аминокислотныхостатков.

Поданным рентгеноструктурного анализа,участки пептидных цепей вблизи петлиобразуют глобулярную структуру, вкоторую включается около 110 аминокислотныхостатков (Рис.5).

Такие глобулы в структуремолекул антител получили названиедоменов.

NH2-концевой домен тяжелой цепи обозначаюткак VH,а три последующих в константной областитяжелой цепи – как СH1,СH2и СH3(для легкой цепи, соответственно VLиCL).

Рис.5.Схематическое изображение локализациидоменных участков в легкой и тяжелыхцепях иммуноглобулинов.

Связываниеантигена происходит в доступнойрастворителю щели активного центра,образованной вариабельными доменамив NH2-концевойчасти легкой и тяжелой цепей. Способностьсвязывать антигены с той же эффективностью,что и нативные молекулы антител, обладаютFabи F(ab’)2-фрагментыиммуноглобулинов.

Основным принципоморганизации антигенсвязывающих центровиммуноглобулинов является полицентроваяструктура. Малые антигенные детерминантысвязываются на ограниченном участкеактивного центра, комплементарномданной детерминанте.

Большие детерминантымогут занимать практически всю областьсвязывания

Источник: https://studfile.net/preview/3053831/

Лекция 13. ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Классификация методов иммунохимического анализа

Молекулярные основы иммунохимического анализа. Специфичность и чувствительность

иммунохимических (серологических) реакций. Уровни регистрации реакций антиген-антитело

(первичный и вторичный).

• Феномен агглютинации. Прямая и непрямая агглютинация. Эритроциты как один из носителей

антигенов в реакциях непрямой агглютинации.

• Феномен преципитации и основанные на нем реакции. Диффузионный метод преципитации и

иммуноэлектрофорез.

• Реакция связывания комплемента. Компоненты, необходимые для постановки реакции. Характеристика

индикаторной системы для суждения об активности комплемента.

• Нейтрализация и усиление биологических эффектов антигена.

• Принцип реакций, основанных на меченых антителах. Варианты меток. Иммунофлюоресцентный и

иммуноферментный анализы. Иммуноблоттинг.

• Значение иммунохимического анализа в биологии и медицине.

Иммунохимический анализ объединяет методы, основанные на реакциях антиген-антитело. Такие реакции часто называют «серологическими», так как до недавних пор единственным источником антител служила сыворотка (лат.

serum) крови иммуннизированных животных. Лишь с внедрением гибридомной технологии антитела стали получать в культурах клеток.

Это существенно повысило специфичность анализа, так как каждая гибридома продуцирует антитела против единственного эпитопа.

С помощью иммунохимического анализа решаются две основных задачи: выявление антител и антигенов. Определение антител проводят в реакциях с известными антигенами, для обнаружения антигенов используют известные антитела. Например, выявление поверхностного антигена вируса гепатита В проводят при помощи антител против HВsAg, а наличие анти-HВs антител тестируют в реакциях с HвsAg.

Главным стимулом для совершенствования иммунохимических методов было (и остается) стремление к повышению их чувствительности: она тем выше, чем меньше концентрация выявляемых антител и антигенов.

Другим мотивом служило изучение антигенных смесей, нацеленное на расшифровку входящих в их состав компонентов.

Сюда примыкает анализ спектра антител, продуцируемых в ходе иммунного ответа, например инфекционного процесса1.

Взаимодействие антиген-антитело исследуют на двух уровнях – первичном и вторичном. В первом случае констатируют лишь сам факт образования иммунного комплекса. Это можно сделать, если антиген или антитело мечены подходящим маркером, например, изотопом.

Такие анализы отличаются максимальной чувствительностью. Вторичный уровень характеризуется внешними (видимыми) проявлениями реакции. Они требуют для своего воспроизведения более высокой концентрации ингредиентов (антигенов и антител), т.е.

менее чувствительны.

Методы, основанные на вторичных (внешних) проявлениях реакции антиген-

антитело (реакции второго уровня)

Внешние (вторичные) эффекты, на которых базируется иммунохимический анализ, включают (1) агглютинацию, (2) преципитацию, (3) связывание комплемента, (4) нейтрализацию или усиление биологических эффектов антигенов.

Агглютинация (от лат. agglutinare – склеивать).Один из ингредиентов реакции (обычно антиген) находится в корпускулярной форме. Антитела выявляются по их способности агглютинировать антигенные частицы, например, бактерии, эритроциты, латекс и пр.

Антиген может быть собственным компонентом частицы либо искусственно сорбирован на ней. В первом случае говорят о прямой агглютинации, второй вариант называется непрямой, или пассивной агглютинацией.

Чувствительность пассивной агглютинации выше, так как плотность антигенных молекул на частицах в этом случае больше, чем на естественных носителях[1].

Одним из распространенных адсорбентов служат эритроциты – реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации.

Преципитация(от лат. precipitare – осаждать).Оба ингредиента находятся в растворимой форме. При их взаимодействии (в определенных концентрациях и соотношениях) образуется осадок.

Наиболее широко используется двойная (или встречная) иммунодиффузия в геле (агар, агароза). В этом случае антиген и антитело мигрируют навстречу друг другу, и каждая пара образует собственную линию преципитации.

Исследуя количество и взаиморасположение линий, можно судить о числе ингредиентов реакции и степени их идентичности (рис. 1-13).

Рис. 1-13. Двойная иммунодиффузия в геле (реакция по Оухтерлони).Анализ фракций сыворотки человека, полученных при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-200. Верхние лунки (слева направо) – фракции с мол.

массой 19S, 7S и 4S; нижние лунки – цельная сыворотка; центральные лунки антитела против сыворотки человека (антисыворотка кролика). Пересекающиеся линии преципитации (верхний ряд) означают, что фракции содержат разные антигены.

Сливающиеся линии нижнего ряда говорят об идентичности антигенов, внесенных в его лунки (цельная сыворотка).

Разрешающую способность метода можно существенно повысить, если смесь антигенов предварительно (перед встречной иммунодиффузией) подвергнуть электрофорезу. В этом случае антигены распределяются на большем пространстве, что

повышает дискретность линий преципитации. Эта методика известна как иммуноэлектрофорез (рис. 2-13). Несмотря на низкую чувствительность иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез незаменимы для решения специальных задач.

Связывание комплемента.Реакция основана на том, что комплексы антиген-антитело (IgM и IgG), активируя (связывая) комплемент, снижают его содержание в сыворотке (см. лекция 10). Это происходит даже тогда, когда иммунные комплексы не обнаруживаются визуально, т.е. не образуют агглютинатов или преципитатов. Поэтому РСК отличается высокой чувствительностью.

О потреблении (связывании) комплемента судят по индикаторной системе, которая выявляет цитолитическую активность комплемента. Такой системой служат эритроциты

Рис. 2-13. Иммуноэлектрофорез (классический вариант).Иммуноэлектрофореграммы двух сывороток человека. В лунки геля были внесены сыворотки и проведен электрофорез.

Затем в центральную траншею были добавлены антитела против сыворотки человека и проведена реакция встречной иммунодиффузии.

По числу линий, каждая из которых соответствует одной паре антиген-антитело, можно судить о количестве компонентов (антигенов) в исследуемом препарате.

барана, покрытые (сенсибилизированные) антиэритроцитарными антителами1, и сыворотка морской свинки (комплемент). Фиксируя комплемент, сенсибилизированные эритроциты (т.е. комплекс антиген-антитело) подвергаются гемолизу.

Напротив, если их добавляют в среду, где произошла реакция антиген-антитело, гемолиз отсутствует, так как комплемент истощается «чужими» иммунными комплексами.

На этом основании судят о присутствии антител (добавление известного антигена) или антигена (добавление известных антител).

Нейтрализация биологических эффектов антигена.Если антиген обладает биологической активностью, антитела можно выявить по ее подавлению.

К такого рода реакциям относится нейтрализация бактериальных токсинов, иммобилизация бактерий, инактивация вирусов и бактериофагов. В диагностической иммунологии широко используется реакция торможения вирусной гемагглютинации.

Она основана на способности антител блокировать агглютинацию эритроцитов антигенами (гемагглютининами) вирусов.

Усиление биологических эффектов антигена.Можно привести два примера, когда антитела усиливают (точнее проявляют) биологическую активность антигенов или их носителей.

Внутрикожная апликация IgE-антител, содержащихся в сыворотке больных атопическими заболеваниями, предрасполагает к местной аллергической реакции на введение (в то же место) специфического антигена (диагностический тест Прауснитца-Кюстнера). Другой пример – опсонический эффект антител в реакциях с фагоцитами.

Здесь антитела после связывания с объектом фагоцитоза (например, бактериями) напрямую или опосредованно (через комплемент) активируют фагоциты (см. лекция 8).

Методы, основанные на меченых антителах (реакции первого уровня)

К этой группе относятся иммунофлюоресцентный, радиоиммунный и иммуноферментный анализы. Они обладают наиболее высокой чувствительностью, так как не зависят от внешних (вторичных) эффектов, связанных с образованием иммунных комплексов.

Иммунофлюоресцентный (иммунолюминесцентный) анализ. Для обнаружения тканевых или микробных антигенов можно использовать антитела, конъюгированные с флюорохромами. Их свечение возбуждается ультрафиолетом и исследуется при помощи специального (люминесцентного) микроскопа. В качестве метки чаще всего применяют флюоресцеин.

Поглощая ультрафиолет с длиной волны 290-495 нм, он испускает видимый свет (флюоресцирует) в зеленой части спектра (525 нм).

При помощи иммунофлюоресцентного метода была впервые установлена природа клеток, синтезирующих антитела, определена локализация иммунных комплексов при аутоиммунной патологии, разработаны новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний.

Метод используется в двух основных вариантах – прямом и непрямом. В первом случае антитела, конъюгированные с флюорохромом, вступают в непосредственный контакт с антигенами, фиксированными на предметном стекле (мазки из инфицированного материала, тканевые срезы). В зонах локализации антигена возникает свечение, обнаруживаемое под люминесцентным микроскопом (рис. 3-13).

Рис. 3-13. Иммунофлюоресцентный анализ (прямой метод).Исследуемый материал, фиксированный на предметном стекле, инкубируют с антителами против искомого антигена, конъгированными с флюоресцеином.

После отмывания препарат микроскопируют в ультрафиолете, отмечая флюоресценцию в зонах связывания меченых антител (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4th ed. J.B. Lippincott Company.

1992).

.

Непрямой, или сэндвич-метод может быть использован для определения как антигенов, так и антител. Реакцию проводят в два этапа (рис. 4-13). Сначала антигены, фиксированные на предметном стекле, обрабатывают немечеными антителами.

После отмывания связавшиеся с антигеном антитела выявляют при помощи антииммуноглобулиновых антител, меченых флюоресцеином.

Это дает возможность пользоваться унифицированным реагентом (меченые антиантитела) для выявления антител к разным антигенам.

Рис. 4-13. Иммунофлюоресцентный анализ (непрямой метод).Исследуемый материал, фиксированный на предметном стекле, инкубируют с немечеными антителами против искомого антигена.

После отмывания препарат обрабатывают флюоресцеин-мечеными антителами против антител, использованных на первом этапе (например, козьи антитела против иммуноглобулинов кролика). Отмывают и анализируют под люминесцентным микроскопом (E. Koneman et al.

Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

.

Радиоиммунный анализ. Меткой служат изотопы, обычно радиоактивный йод. Одним из распространенных вариантов является количественное определение антигенов по конкурентному связыванию с антителами.

Принцип основан на ослаблении реакции между антителами и меченым антигеном в присутствии того же, но немеченого антигена. Чем больше антигена в исследуемом образце, тем больше антител будет им заблокировано и тем меньше антител останется для связывания меченого антигена, вносимого в ту же систему.

Измеряя радиоактивность иммунных комплексов, можно судить о содержании антигена в исследуемом материале.

Для отделения иммунных комплексов от непрореагировавших ингредиентов предложены разные способы. Самый популярный основан на принципе твердофазных сорбентов. В этом случае антитела фиксируются на инертных частицах, которые легко осаждаются при центрифугировании. Вместе с ними будут оседать и связанные (в том числе меченые) антигены.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Неудобство работы с радиоактивными изотопами побудило к разработке реакций, основанных на антителах и антигенах, конъюгированных с ферментами, чаще с пероксидазой (ее получают из хрена).

Присутствие энзиммеченых молекул можно обнаружить визуально или спектрофотометрически по изменению цвета хромогенного субстрата, чувствительному к данному ферменту1.

Реакция отличается высокой чувствительностью, так как для ее выявления достаточно ничтожной концентрации фермента (10-15 моль/л и ниже).

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА2. Он основан на том, что один из ингредиентов (антиген или антитело) фиксируется на инертном носителе (обычно полистироле), выполняя роль иммуносорбента.

Существуют разные модификации метода. В их основе лежат принципы, о которых уже говорилось в связи с иммунофлюоресцентным и радиоиммунным анализами. На рис.

5-13 и 6-13 прокомментированы два варианта ИФА, широко используемые в диагностике инфекционных заболеваний.

Рис. 5-13. Определение антител в ИФА (непрямой метод). Антигены сорбируют на инертном носителе (лунки полистиролового микропланшета). На первом этапе в лунки добавляют исследуемую сыворотку. Антитела (Ат1) связываются с антигенами. После отмывания в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов человека («античеловеческий иммуноглобу-

лин»), конъгированные с ферментом (второй этап).

После отмывания добавляют хромогенный субстрат (например, смесь о-фенилендиамина и перекиси водорода при метке пероксидазой) и каждую лунку спектрофотометрируют относительно негативного (сыворотка без антител) и позитивного (сыворотка с искомыми антителами) контролей (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

Рис. 6-13. Определение антигенов в ИФА (принцип «ловушки»). Исследуемый материал (антиген)) вносят в лунки полистиролового микропланшета, где предварительно фиксируют антитела против искомого антигена (первый этап). Антигены связываются с антителами, закрепляясь на сорбенте.

После отмывания в лунки добавляют энзиммеченые антитела (Ат-энзим) против того же антигена (второй этап). Они фиксируются на сорбенте за счет связывания со свободными эпитопами антигена. После отмывания определяют активность фермента, закрепившегося на сорбенте (третий этап).

Ее величина будет пропорциональна концентрации антигена в исследуемом материале (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4th ed. J.B. Lippincott Company. 1992). На втором этапе можно использовать немеченые антитела.

Об их связывании с антигеном судят при помощи энзиммеченых антител против имуноглобулинов человека (см. рис. 5-13). Это позволяет унифицировать энзиммеченый реагент, хотя и усложняет реакцию (многослойный сэндвич).

Иммуноблоттинг («Western Blot”). На основе ИФА разработан один из самых специфичных и чувствительных методов иммунохимического анализа – иммуноблоттинг (от англ. blot – промокать, пятно).

Он сочетает ИФА с электрофорезом и предназначен для изучения спектра антител к антигенным смесям.

Кроме решения научных задач, это имеет важное значение в диагностике некоторых инфекций (таких как гепатит С и СПИД) для исключения ложноположительных результатов «обычного» ИФА (они изредка возникают за счет перекрестно реагирующих («неспецифических») антител).

Рис. 7-13. Иммуноблоттинг.Определение спектра анти-ВИЧ антител. Этап 1: Вирусные антигены (белки (p), гликопротеины (gp)) подвергаются электрофорезу в блоке полиакриламидного геля. Это ведет к разделению антигенов на фракции по молекулярной массе (мол. масса в кДа отмечена цифрами).

Этап 2: Фракции антигена переносят при помощи электрофореза на нитроцеллюлозную мембрану, которую разрезают на полоски (стрипы). Этап 3: Стрипы инкубируют с исследуемой сывороткой и затем отмывают от несвязавшегося материала. Этап 4: Стрипы инкубируют с энзиммечеными антителами против иммуноглобулинов человека, отмывают.

Этап 5: Добавляют хромогенный субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен). Они совпадают с зоной локализации антигенов, которые прореагировали с антителами исследуемой сыворотки. В данном случае сыворотка содержит антитела против gp41, p24 и р31. Это доказывает диагноз ВИЧ-инфекции (E. Koneman et al.

Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

Принцип метода (на примере выявления антител к вирусу иммунодефицита человека) показан на рис. 7-13. Смесь антигенов, экстрагированных из исследуемого объекта (в данном случае ВИЧ), разделяют на фракции при помощи электрофореза в полиакриламидном геле.

Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и, используя электрофорез, воспроизводят на ней точную копию белковых фракций, полученных в полиакриламидном блоке1. На заключительном этапе полоски (стрипы) нитроцеллюлозы анализируют в реакции ИФА с исследуемой сывороткой. Количество выявленных фракций (пятен) отражает спектр антител к антигенам анализируемой смеси.

Наличие антител к двум и более антигенам предполагаемого возбудителя не может быть случайным, подтверждая диагноз заболевания.

В последние годы разрабатываются методы, позволяющие одновременно дифференцировать множество (несколько тысяч) антигенов. Они основаны на использовании наборов (библиотек) рекомбинантных антител, принципиально новых микросорбентов (чипсов, англ.

chips) и методов ультраточечной регистрации реакций (лазерная десорбционно-ионизационная масс-спектроскопия, плазмоновый резонанс и др.). Это открывает новые перспективы для функциональной генетики (расшифровка протеома, т.е.

всех белков, закодированных в геноме клеток), сравнительного картирования белков нормальных и патологических (в частности, раковых) клеток, изучения фармакологических воздействий и пр.

Тесты для самоконтроля

1. Обязательные ингредиенты иммунохимических (серологических) реакций:

1. Антигены. 2. Комплемент. 3. Цитокины. 4. Антитела. 5. MHC(HLA).

(1,4)

2. Иммунохимические реакции 1-го уровня:

1. Преципитация. 2. Пассивная агглютинация. 3. Прямая агглютинация. 4. Реакция связывания комплемента. 5. Реакции на основе меченых антител. 6. Реакции нейтрализации.

(5)

3. Иммунохимические реакции 2-го уровня:

1. Преципитация. 2. Пассивная агглютинация. 3. Прямая агглютинация. 4. Реакция связывания комплемента. 5. Реакции на основе меченых антител. 6. Реакции нейтрализации.

(1,2,3,4,6)

4. Методы иммунохимического анализа, основанные на феномене преципитации:

1. Реакция двойной иммунодиффузии в геле. 2. Реакция непрямой гемагглютинации.

3. Иммуноэлектрофорез. 4. Реакция связывания комплемента. 5. Иммуноблоттинг.

(1,3)

Источник: https://studopedia.su/10_97768_lektsiya--immunohimicheskiy-analiz.html

Классификация методов иммунохимического анализа: При оценке возможностей и отнесении того или иного метода

Классификация методов иммунохимического анализа

При оценке возможностей и отнесении того или иного метода иммуноанализа (ИА) к определенному типу во внимание принимаются главным образом следующие факторы: принцип, лежащий в основе проведения ИА; способ проведения стадий анализа (гомогенный, гетероген ный); возможность осуществления ИА в статическом или кинетическом режиме; характеристики используемых иммунореагентов; способ определения концентрации иммунокомплексов; тип используемой метки; способ детекции аналитического сигнала. По принципу; лежащему в основе проведения ИА, можно выделить три группы иммунохимических методов: неконкурентные, конкурентные и проходящие в неравновесном режиме. Если на первой стадии в системе присутствует только анализируемое соединение и задействованы соответствующие ему центры связывания (специфические Ат и Аг), то метод является неконкурентным. Условные обозначения Ат и Аг, используемые в схемах иммунохимических взаимодействий, приведены на рис. 2.13. В общем плане схема неконкурентного варианта ИХА представлена на рис. 2.14. В первом случае (тип 1) возрастание концентрации определяемого вещества сопровождается увеличением концентрации образующегося специфического иммунокомплекса и, следовательно, более высоким аналитическим сигналом. Количество образовавшихся специфических иммунных комплексов может быть намного меньше, чем общее количество мест связывания. Во втором случае (тип 2) выявляют оставшиеся свободными центры связывания, чаще всего с помощью метки. Концентрация образовавшихся на первой стадии комплексов вычисляется по разности начальной концентрации центров специфического связывания и измеряемой экспериментально концентрации оставшихся свободными центров специфического связывания. Для достижения достаточной разности необходимо, чтобы количество образующихся иммунных комплексов было сравнимо с количеством оставшихся свободными центров специфического связывания. Метка при этом должна содержаться в компоненте, который образует комплекс с анализируемым веществом. Чтобы количественно перевести анализируемое соединение в комплекс, меченый реагент необходимо брать в избытке. Для отделения комплекса от избытка меченого реагента используют иммобилизацию анализируемого соединения на твердой поверхности. В этом случае комплекс Аг—Ат остается на поверхности, а избыток меченого соединения легко удаляется. При неконкурентном связывании определяемое вещество должно содержать две не перекрывающиеся антигенные детерминанты. Этот метод применяется для анализа веществ с молекулярной массой более 1000, имеющих как минимум две антигенные детерминанты (эпитопы). Для анализа большого числа моновалентных Аг он не- Рас. 2.14. Схема неконкурентного варианта иммунохимического анализа

применим. На стадии выявления специфического иммунокомплекса Аг оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых Ат, что и послужило основанием для названия метода «сэндвич»-анализ (от англ, sandwich). В этих методах избыток работающих Ат прямо или опосредованно связывают с твердой фазой. Вторые меченые Ат против другого эпитопа добавляют или одновременно при связывании с Ат первого типа (одностадийный метод), или после завершения стадий связывания и отмывки (двухстадийный метод). После завершения иммунологической реакции количество связавшегося с твердой фазой вещества непосредственно зависит от количества определяемого вещества в пробе (рис.

2.15). Широко распространена конкурентная версия ИА. При этом достаточно одной антигенной детерминанты на определяемом веществе. В конкурентном варинте ИХА обычно используют меченые иммунореагенты. На первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченое анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за имеющиеся в отно- Стадия 1              Стадия 2              Стадия 3 Рис. 2.15. Схема неконкурентного варианта иммунохимического анализа — «сэндвич*-анализ: стадия 1 – взаимодействие между иммобилизованными антителами и определяемыми антигенами; стадия 2 – взаимодействие образовавшегося иммунного комплекса с вторичными антителами; меченными ферментом; стадия 3 – визуализация результатов взаимодействия с вторичными антителами; Е – фермент, S – субстрат, Р – продукт ферментативной реакции сительном недостатке центры специфического связывания. По завершении реакции количество меченого реагента, связанного с твердой фазой, будет обратно пропорционально количеству определяемого вещества в образце (рис. 2.16). Предел обнаружения конкурентных методов ограничен как чувствительностью регистрации метки, так и аффинностью Ат, в то время как для неконкурентных методов, при отсутствии неспецифических взаимодействий, — только чувствительностью определения метки. Поэтому для достижения высокой чувствительности анализа конкурентным методом необходимо использовать высокоаффинные Ат, что не всегда достижимо на практике. Максимальная чувствительность достигается при проведении анализа в равновесном ре- жиме. Другой недостаток конкурентных методов иммунохимичес- кого анализа заключается в том, что возможно влияние различных эффекторов, содержащихся в анализируемых образцах, например в биологических жидкостях (сыворотке крови, соке растений), на свойства метки. Подобный эффект может быть устранен путем многократного разведения исходного образца. При неравновесном режиме проведения ИХА используется одна антигенная детерминанта и строго контролируется избыток реагента. Этот метод является предельным вариантом неконкурентных методов; его называют одноцентровым иммунометрическим анализом и используют в основном для определения гаптенов (Аг с молекуляр- Рис. 2.16. Схема конкурентного варианта иммунохимического анализа: 1 – определяемый антиген (Аг): 2 – конъюгат антигена с ферментом (Аг*); 3 – иммунные комплексыАт—Аг*; 4 – несвяэавшийся конъюгат, 5 – визуализация результатов конкурентного взаимодействияопределяемого антигена и меченого; Е – фермент, S – субстрат, Р – продукт ферментативной реакции ной массой менее 1000). В этом методе определяемое вещество связывается со строго определенным избытком меченых Ат или, еще лучше, Fab-фрагментов (фрагменты антител, сохраняющие способность связывать антигены и образовывать иммунные комплексы). Для обеспечения одноцентрового связывания далее в систему добавляют Аг или антивидовые Ат на твердом носителе для удаления не связавшихся Ат. По способу проведения всех стадий анализа выделяют гетерогенные (с участием твердой фазы) и гомогенные (осуществляющиеся только в растворе) методы И ХА. К гетерогенным относятся не только методы, основанные на применении твердой фазы с иммобилизованным ферментом, но и использующие разделение на фазы путем осаждения иммунных комплексов. Такой процесс осуществляется введением в систему дополнительных растворимых компонентов (соль, полиэтиленгликоль, спирт, вторичные Ат, белок А и др.). Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации Ате последующим специфическим связыванием Аг и выявление образовавшихся иммунокомплексов являются отличительными признаками гетерогенного анализа (см. рис. 2.15,2.16). Если же образование неспецифических иммунокомплексов происходит в растворе, а лишь затем для целей разделения используют твердую фазу с иммобилизованным реагентом, то такие методы классифицируют как гомогенно-гетерогенные. В гетерогенном варианте ИХА реализуется стадия отделения образующихся иммунохимических комплексов от свободных, не вступивших в реакцию компонентов, что позволяет предотвратить агрегацию в растворе. При этом достигается высокая специфичность, чувствительность по сравнению с гомогенным анализом, где все стадии протекают в растворе. Гетерогенный анализ, как правило, более длительный, чем гомогенный и гомогенно-гетерогенный. Это связано с тем, что скорость достижения равновесия в системе иммобилизованный реагент — анализируемое соединение зависит не только от концентрации компонентов, оно может снижаться за счет микродиффузионных эффектов из-за затрудненности продвижения реагентов из раствора к активным центрам иммобилизованного компонента. К недостаткам гетерогенного анализа можно отнести также: возможность неспецифического связывания компонентов с носителем, методические сложности из-за трудности точного дозирования и промывок иммуносорбентов на основе пористых носителей, влияние неоднородности сорбционных свойств полимерных носителей на точность и воспроизводимость результатов анализа. Эти недостатки устраняются при переходе к гомогенным видам анализа. Гомогенный анализ основан на изменении сигнала, возникающем при комплексообразовании с исследуемым Ат или Аг. Преимуществами гомогенного анализа являются: возможность использования малых объемов анализируемого образца (5—50 мкл), отсутствие стадии его предварительной обработки. Гетерогенный ИХА используется гораздо чаще и применяется для определения широкого круга соединений. При осуществлении такого анализа необходимо провести эффективное отделение иммунокомплексов от свободных компонентов. Эту проблему оказалось легко решить, если один из компонентов комплекса Аг—Ат прочно иммобилизовать (связать) на твердом носителе. При этом используются адсорбционные и избирательные свойства различных мембран для иммобилизации иммунореагентов. Твердых носителей существует очень много: трубки (стеклянные, полистирольные, полипропиленовые, с ионными смолами), гранулы (активированного полистирола, оксида алюминия, карбоната кальция, стекла пористого), мелкие частицы (полиакриламида, сефарозы, агарозы, декстрана), микропланшеты или полоски, карточки, стержни, электроды (платиновые, из различных видов графита), пленки или волокна (стеклянные, кварцевые, целлюлозные). Иммобилизация осуществляется или за счет адсорбции иммунореагентов на поверхности твердых носителей, или за счет ковалентного связывания. Кроме того, к носителям добавляются различные модификаторы, которые обеспечивают лучшую «пришивку» иммунореагентов к поверхности и способствуют улучшению их стабильности внутри или на поверхности твердой фазы. Возможность прочного связывания на носителе Аг или Ат должна сочетаться с сохранением способности их к специфическому образованию иммунокомплексов. Все это способствует развитию принципов твердофазного анализа и внедрению их в новые варианты ИХА. Гетерогенный (твердофазный) ИА послужил основой для развития аналитических иммунных систем, в которых процессы узнавания образа и его детекции совмещены во времени и пространстве. Такие системы получили название иммуносенсоров. Аналитическое применение иммуносенсоров с различными вариантами детекции для решения задач селективного и высокочувствительного определения биологически активных соединений (токсикантов) будет рассмотрено в разделах 2.3.5,2.4.2,2.4.3, 2.5.2—2.5.6. Одно из основных требований, которые предъявляются к современным методам анализа, — возможность экспрессного определения биологически активных соединений, в том числе и токсикантов. Длительность же анализа определяется в основном временем проведения одной или нескольких последовательных иммунохимических реакций. Известно, что максимальная чувствительность анализа достигается при проведении стадии взаимодействия определяемого вещества с соответствующими специфическими центрами связывания в равновесном режиме, что реализуется при проведении анализа в статическом режиме. Сокращения времени проведения анализа и количества анализируемой пробы можно достичь при переходе в кинетическую область, хотя при этом происходит частичная потеря чувствительности определения тестируемого аналита. Необходимым условием для получения воспроизводимых результатов в таком режиме является постоянство таких параметров, как время контакта реагентов, температура и объем анализируемой пробы. Кинетический иммуноанализ можно проводить в нескольких вариантах: непроточном, проточном и с применением техники проточно-инжекци- онного анализа. Наиболее перспективен методический подход основанный на создании автоматических устройств для проведения кинетического иммуноанализа в проточных реакторах, так как при этом можно изменять время контакта компонентов, регулируя скорость потока. На тип и возможности иммуноанализа огромное влияние оказывают вид и чистота используемых иммунореагентов и их стандартов. Ат являются одним из наиболее важных реагентов при определении Аг методом иммуноанализа. Для получения высокоспецифичных антител необходимо использование специальных приемов, включающих иммунизацию животных, приготовления антисыворотки, выделение и характеристику полученных Ат. Помимо классов (типов) антитела (например, иммуноглобулины А) подразделяются на подтипы (IgGl, lgA2a и т.д.). Существуют, как мы знаем, также поли- и моноклональные Ат, моно-, би- или поливалентные, нативные или полученные химическим или генно-инженерным путем. Такое многообразие видов Ат послужило основой для классификации методов ИХА по типу используемых Ат. Наиболее часто применяются ИА с использованием моно- или поликлональных Ат. Принципиально важным является то, что поликлональные Ат даже против одной антигенной детерминанты гете- рогенны как по структуре активного центра, так и по физико-химическим свойствам. Состав Ат зависит при этом от вида животного и стадии иммунного процесса. Моноклональные Ат проявляют более высокую специфичность по сравнению с поликлональными Ат, которые представляют собой смесь молекул Ат разных классов и разной специфичности. Для моноклональных Ат характерна более высокая аффинность (константы аффинности могут быть на несколько порядков выше по сравнению с поликлональными Ат). Моноклональные Ат могут быть использованы для стандартизации иммунореагентов, поскольку их можно получить в больших количествах. В роли Аг может выступать любое чужеродное, как высокомолекулярное, так и низкомолекулярное, соединение, в том числе и токсикант. В ряде случаев определенное осложнение представляют перекрестные реакции, т.е. неспецифические реакции с соединениями, близкими по химической структуре. В основе перекрестного реагирования антигена лежит структурное подобие или полное сходство с детерминантами специфического антигена. Перекрестные реакции могут быть причиной ложных положительных иммунологических реакций. Комплементарность специфического Аг должна быть выше, чем перекрестно реагирующего структурного аналога. В случае тщательно подобранных условий можно ожидать высокоспецифичного связывания Аг с Ат. Иногда прямое определение Ат или Аг методами И ХА затруднено или невозможно, и тогда для определения исходной концентрации анализируемого соединения достаточно оценить количество образовавшихся иммунных комплексов. Для такой оценки существует два подхода: прямое измерение концентрации образовавшихся иммунокомплексов и определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступивших в специфическую иммунореакцию Ат или Аг. При крайне низких концентрациях компонентов образование простого бинарного комплекса Аг—Ат не может быть зарегистрировано ни визуально, ни простыми инструментальными методами, что вызывает необходимость усложнения аналитической системы. Одним из путей визуализации образующихся иммунокомллексов при низких концентрациях иммунореагентов является использование меченых соединений, в которых метка может легко детектироваться современными способами, обеспечивающими высокую чувствительность, точность и объективность регистрации результатов. От типа метки зависит и название анализа — радиоиммунологичес- кий, иммуноферментный, флуоресцентный и т.д. Развитие ЙХА началось срадиоиммунологического анализа (РИА), предложенного еще в конце 1950-х гг. Благодаря возможности определять радиоактивную метку в очень малых концентрациях удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). Большинство определений с помощью РИА основано на использовании в качестве радиоактивной метки изотопов иода ,251 и 1311, однако меченые ими Ат недостаточно стабильны in vivo, а процесс ме- чения достаточно трудоемок. Для этих целей используют и другие радиоактивные изотопы, в частности изотопы металлов 57Со,1,1 In. РИА наряду с несомненными достоинствами имеет и определенные недостатки: ограниченный срок жизни радиоактивной метки, необходимость специального оборудования, возможность радиоактивного заражения при проведении большого числа анализов, необходимость соблюдения специальных мер предосторожности и высокой квалификации персонала. Сочетание высокой специфичности реакции Аг—Ат с высокой каталитической активностью ферментов привело к созданию им- муноферментного анализа (ИФА). Принципиальная возможность применения ферментов в качестве меток в ИФА обусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации процессов с участием ферментов в растворе. Новые направления развития ИФА связаны с использованием различных методов регуляции ферментативной активности. Такая регуляция может осуществляться как химическим путем (с помощью активаторов, ингибиторов, субстратов), так и физическим (путем изменения активности ферментов при образовании комплекса Аг—Ат, с помощью ультразвука, диффузионных и конформационных ограничений). К преимуществам ИФА по сравнению с РИА относится большая стабильность реагентов, сокращение времени анализа, отсутствие специальных мер защиты. Процесс ИФА можно разделить на три основные стадии: формирование специфического комплекса Аг—Ат, введение в него ферментной метки и визуализация метки каким-либо физическим способом. Следует отметить, что большинство вариантов иммунохи- мического анализа относится к иммуноферментным методам. С иммуноферментным анализом конкурирует флуоресцентный иммуноанализ (ФИА), который появился в 1941 г. При этом ФИА объединил высокую чувствительность люминесцентного анализа с не менее высокой специфичностью иммунохимического. Тем самым была впервые сформулирована и практически реализована идея меченых диагностических иммунохимических реактивов (Ат или Аг), что привело к появлению ФИА. Поскольку флуоресценция является частным случаем люминесценции (быстро затухающая люминесценция), различают люминесцентный и флуоресцентный иммуноанализ. В свою очередь люминесцетный ИА можно подразделить на биоаю- минесцентный анализ, в основе которого лежит биолюминесцентная реакция, катализируемая люциферазами светляков и бактерий, и хемилюминесцентный иммуноанализ. Интенсивность излучаемого в ходе этих реакций света может быть зарегистрирована с высокой чувствительностью. Преимуществом люминесцентных систем является возможность регистрации интенсивности излучения в широком диапазоне значений, что соответствует большому интервалу концентраций определяемых веществ. Люминесцентные методы не требуют, в отличие от флуоресцентных, дополнительных источников возбуждения для их проведения, вследствие чего упрощается поста новка эксперимента и устраняется фоновое рассеяние. В качестве детектирующих систем применяются люминометры, которые регистрируют интенсивность свечения. Существуют различные флуоресцентные метки, которые вводят в определяемый фрагмент. По окончании реакции измеряют интенсивность флуоресцентного комплекса Аг—Ат или раствора, оставшегося после его отделения. Флуоресцентный ИА получил развитие как стабильный, недорогой, быстрый и достаточно чувствительный иммунохимический метод. Общепринятые флуоресцентные метки имеют высокий квантовый выход, но не могут использоваться в методах иммунохимичес- кого анализа, где одновременно определяется несколько соединений, так как они имеют широкий спектр, создавая трудности разделения эмиссионных пиков. Наиболее узкие эмиссионные пики при различающихся длинах волн имеют такие флуоресцентные метки, как тербий ТЬ3+ при 544 нм, европий Еи3+ при 613 нм и самарий Sm3+ при 643 нм. Кроме того, время жизни флуоресцентной метки на фоне присутствующих в биологических жидкостях примесей можно изменять от 50 до 1000 мкс в зависимости от температуры и используемых растворителей. Разновидностью ФИА является поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА), основанный на изменении степени поляризации флуоресценции. Этот метод применяют в основном для определения низкомолекулярных соединений. Гаптен конъюгируют с флуоресцентной межой. В свободном состоянии такой конъюгат в растворе подвижен, и поляризация проходящего через раствор света мала. При связывании с Ат подвижность такого конъюгата ограничивается, что приводит к повышению степени поляризации света. Количество гаптена в образце определяется по изменению поляризации света при замещении им меченого гаптена у связывающих мест Ат. Используются электроактивные метки, такие как металлоорганические, координационные соединения и непосредственно ионы металлов. Электрохимический контроль иммунологических реакций осуществляется с помощью потенциометрического или амперометрического способов детекции электроактивной метки. В отличие от ИФА, где электрохимический контроль биоспецифических взаимодействий возможен благодаря использованию таких фермент-суб- стратных реакций, которые приводят к образованию электрохимически активных продуктов (может быть активен в этом плане и используемый субстрат), здесь сама метка электроактивна, что позволяет существенно упростить анализ. В качестве металлосодержащих меток было предложено использовать соединения ртути и железа, хотя в принципе любой металл может реагировать с подхо дящим органическим лигандом. Были получены гаптены, меченые хромом, медью, кобальтом, палладием, марганцем, платиной, золотом. Для проведения анализа необходимо разделять связанную и свободную фракции метки. Металлосодержащие метки можно вводить как в низко-, так и в высокомолекулярные Arc их последующим электрохимическим детектированием в определенной области потенциалов в зависимости от условий определения. Для детекции биоспецифических реакций на заключительной стадии иммуноанализа чаще всего используют следующие методы: электрохимические; оптические; чувствительные к изменению массы. Методы иммуноанализа с электрохимическим контролем все чаще входят в практику ИХА. Для этих целей используют потен- циометрию, амперометрию, кулонометрию и кондуктометрию. Простота выполнения анализа, невысокая стоимость, экспрес- сность определений дают им преимущества перед другими методами ИХА. Среди оптических методов наиболее часто используют спектрофотометрический, люминесцентный, биолюминесцентный, хемилюминесцентный, флуоресцентный. Оптические методы детекции, основанные на измерении излучаемого или поглощаемого света видимой или ультрафиолетовой частей спектра, были наиболее популярны до последнего времени. Однако в настоящее время предпочтение отдают флуориметрическим или люминесцентным способам детекции. К группе методов, чувствительных к изменению массы, относятся пьезоэлектрический и акустический на поверхностных волнах. Пьезоэлектрические датчики основаны на использовании различных пьезокварцевых кристаллов с частотой осцилляции 9—14 МГц. Наиболее часто используют кварцевые кристаллы из-за их химической стабильности в водных растворах и способности переносить высокие температуры без потери пьезоэлектрических свойств. Измерение частоты осцилляции позволяет определять изменение массы, которое пропорционально концентрации определяемого вещества. Этот принцип и положен в основу разработки соответствующих аналитических устройств.

В последнее время все чаще применяется детекция акустических волн, чувствительных к изменению массы. В этом методе также используются пьезокристаллы, но с частотой осцилляции 30—200 МГц. Адсорбция образца на кристалле замедляет акустические волны; изменение скорости распространения волны пропорционально концентрации определяемого вещества. 

Источник: https://bookucheba.com/himicheskaya-zaschita-radiatsionnaya/klassifikatsiya-metodov-immunohimicheskogo-65481.html

Book for ucheba
Добавить комментарий